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TLL脂肪酶C末端修饰对其底物选择性的调节作用

2018-12-22谭熙钰赵泽鑫杨博王永华

现代食品科技 2018年11期
关键词:甘油酯脂肪酶甘油三酯

谭熙钰,赵泽鑫,杨博,王永华

(1.华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640)

(2.华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州 510006)

自然界中存在的绝大多数脂肪酶(EC 3.1.1.3)能够催化水解甘油三酯,但是有少量的脂肪酶被鉴定为不具备接纳甘油三酯(TAG)底物但能够催化水解甘油二酯和单酯,这类脂肪酶被称为偏甘油酯脂肪酶[1~4]。因其具有特殊的底物选择性,所以偏甘油酯脂肪酶在食品工业和医药保健品生产等领域有广阔的应用空间。例如,使用偏甘油酯脂肪酶生产高纯度甘油二酯(DAG)[5,6],食用乳化剂[7],共轭亚油酸酯[8],生物柴油[9]等。虽然偏甘油酯脂肪酶已经被广泛使用,但是引起其特殊底物选择性的分子机制并不清楚。

脂肪酶的 C末端常常与其功能有密切关系。Barbara Koch等[10]人发现酵母甘油三酯脂肪酶Tgl3p的C末端具有结合脂质底物和维持整体结构稳定的功能。Hung Kuo-Sheng等[11]人通过比较来源于Candida rugosa的同源脂肪酶LIP1-LIP4的序列和功能发现,C末端可以调节酶的活力、热稳定性及界面特性。Chen C.K.等[12]人通过分析古菌Archaeoglobus fulgidus脂肪酶与多种底物的复合物结构发现,其C末端能够帮助结合长链的脂肪酸从而调节脂肪酶的链长选择性。Broedl UC等人[13]也认为内皮脂肪酶的C末端对其底物偏好性起到了调节作用。由此可见,脂肪酶的C末端的变化能够对其功能产生重要的影响。

现在已经被鉴定并报道的偏甘油酯脂肪酶,几乎都属于RML真菌脂肪酶家族。该脂肪酶家族既包括了大量的甘油三酯脂肪酶,如被广泛应用的米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor mieheilipase,RML),疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosuslipase,TLL)和米根霉脂肪酶(Rhizopus oryzaelipase,ROL)等,也拥有沙门柏干酪青霉脂肪酶(Penicillium camembertilipase,PCL),米曲霉脂肪酶(Aspergillus oryzaelipase,AOL),马来色球菌(Malassezia globosa)脂肪酶LIP和MgMDL2等偏甘油酯脂肪酶。这些脂肪酶基因虽然来源于不同的真菌,但是它们都具有一定的序列和空间相似性[14]。同时,大量RML家族脂肪酶的晶体结构已经被解析[15~17],这为研究偏甘油酯脂肪酶特异的底物选择性的分子基础提供了可能。本研究将通过序列比对和结构分析的方法发现甘油三酯脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶的差异,再以甘油三酯脂肪酶TLL为模板,将不保守的偏甘油酯脂肪酶AOL的C端与TLL进行置换,考察并总结酶突变体的生化特性变化规律,从而揭示调节脂肪酶底物选择性的分子基础。

表1 TLL突变体的短引物序列Table 1 Short primers for TLL mutant

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

重组疏棉状嗜热丝孢菌TLL脂肪酶质粒PGAPZαA-TLL由本实验室构建并保存。PrimeSTAR高保真DNA聚合酶和限制性内切酶DpnI购于大连宝生物有限公司(TaKaRa);酵母提取物和蛋白胨购自英国Oxoid公司;突变引物、博来霉素和BCA蛋白定量试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司;三油酸甘油酯和油酸购于Sigma-Aldrich公司;其他试剂均为市售国产分析纯。主要仪器有大连宝生物工程(TaKaRa)有限公司PCR仪、美国Waters 1525高效液相色谱仪和瑞士Tecan公司Infinite F50酶标仪。

1.2 实验方法

1.2.1 突变体TLL_CC的构建

基于QuikChangeTMPCR扩增的突变方法将AOL的C端置换至TLL。考虑到突变的片段太长,先合成了四条短引物,序列见表 1,将合成的短引物等体积混合以扩增出全长突变引物5’-GTGACCCGAAAC GATATTGTCAAAATTGAAGGTTATGTTAATTTT AAGGGCAATACAGGTACATCCGGAGGTTTACCT GATTTGTTGGCTTTTCATGCACATTTGTGGTATT TTGGGTTAATTGGGACA-3’。扩增全长突变引物的反应体系见表2。

表2 全长突变引物扩增的反应体系Table 2 Reaction system for amplifying full-length primer of mutant

PCR反应程序:94 ℃预变性5 min;98 ℃变性10 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸10 s,20个循环;72 ℃1 min。再以PGAPZαA-TLL为模板,上一步PCR扩增产物为引物扩增出置换 C末端的突变体质粒PGAPZαA-TLL_CC,PCR反应体系见表3。

表3 突变体质粒扩增的反应体系Table 3 Reaction system for amplifying plasmid of mutant

PCR反应程序:98 ℃预变性3 min;98 ℃变性10 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸4 min,31 个循环;72 ℃10 min。

通过限制性内切酶 DpnI对模板进行消化,将突变体质粒转化到大肠杆菌DH5α中,完成突变体的构建。突变体质粒通过DNA测序验证,电转至毕赤酵母X-33中表达。

1.2.2 TLL脂肪酶及突变体的表达与纯化

将种子液按5%的接种量接至500 mL YPD培养基中,30 ℃,200 r/min培养72 h。将发酵液在4 ℃,12000 r/min离心10 min除去菌体,上清液经过0.45 μm滤膜过滤后,用10000 u切向流超滤膜包浓缩并换盐至pH 8.0的20 mM Tris-HCl缓冲液。使用Q阴离子交换(Q-Sepharose FF)层析纯化,以pH 8.0含0.15 M NaCl 20 mM Tris-HCl缓冲液洗脱,得到高纯度蛋白。

1.2.3 温度和pH对TLL脂肪酶及突变体活力的影响

TLL脂肪酶及突变体的水解活力使用乳化橄榄油法[18]测定。在100 mL的反应瓶中分别加入4 g橄榄油乳化液和5 g缓冲液。对照组先在反应瓶中加入10 mL 95%乙醇,再将实验组和对照组放入一定温度的水浴摇床预孵育。待孵育5 min后,将1 mL酶液分别加入到对照组和实验组中反应 5 min,再迅速往实验组中加入10 mL 95%乙醇终止反应。以1%酚酞为指示剂,用0.05 mol/L NaOH滴定的方法确定反应瓶中混合物的酸价,以此计算酶活。

在确定温度对脂肪酶活力的试验中,水浴摇床设置的温度分别为25、30、35、40、45、50、55和60 ℃,转速为250 r/min。反应体系中使用的缓冲液为0.1 M pH 7.0的磷酸盐缓冲液。

在确定pH对脂肪酶活力的试验中,水浴摇床设置的温度为35 ℃,转速为250 r/min。反应体系中使用的缓冲液为pH分别为4、5(0.05 M柠檬酸缓冲液)、6、7、8(0.1 M磷酸盐缓冲液)和9(0.1 M Tris-HCl缓冲液)。

1.2.4 TLL脂肪酶及突变体的底物选择性

1.2.4.1 甘油三酯水解实验

在10 mL具塞反应瓶中加入1 g三油酸甘油酯,再加入20 mM pH 7.0磷酸盐缓冲液200 μL和50个水解酶活单位的TLL脂肪酶或其突变体TLL_CC酶液于35 ℃下反应72 h。分别在3、6、9、12、24、36、48、60和72 h取样,每次取30 μL,加入970 μL含0.5 g无水硫酸钠溶解。样品经0.22 μm滤膜过滤待测。

1.2.4.2 酯化实验

在10 mL的具塞反应瓶中加入2 g油酸和0.5 g甘油,再加入2%(W/V)的20 mM pH 7.0磷酸盐缓冲液和含2 mg的TLL脂肪酶或其突变体TLL_CC的冻干粉于35 ℃下反应72 h。分别在3、6、9、12、24、36、48、60和72 h取样,每次取30 μL,加入970 μL含0.5 g无水硫酸钠的流动相溶解。样品经0.22 μm滤膜过滤后待检测。

1.2.4.3 HPLC检测油脂成分

高效液相检测分析使用色谱柱,Phenomenex Luna 5 u silico (2) 100 Å (250 mm×4.6 mm);流动相为正己烷-异丙醇-甲酸(体积比 15:1:0.003);流速,1.0 mL/min;柱箱温度,30 ℃;检测器温度,35 ℃;进样量,10 μL。根据标样保留时间定性,记录产物中各物质峰面积。

1.2.5 同源模建

以TLL脂肪酶的开放构象(PDB code:1EIN)为模板,使用MODELLER软件构建突变体 TLL_CC和AOL的开放构象。使用CHIMERA软件在真空中对各构象进行能量最小化。所有的结构图像由PYMOL制作。

1.2.6 数据统计分析

每组实验均设三个平行并重复三次,利用GraphPad软件对实验数据进行方差分析以及作图。当p<0.05 时,差异性显著。

2 结果与讨论

2.1 甘油三酯脂肪酶与偏甘油酯脂肪酶的结构分析

图1 RML脂肪酶家族成员的多序列比对(a)及TLL脂肪酶C末端替换区(b)Fig.1 The multiple sequence alignment of RML family lipase (a)and the exchanged region in C-terminus of TLL lipase (b)

如图1a所示,TLL脂肪酶除了与两个甘油三酯脂肪酶 GZEL(玉米赤霉脂肪酶,Gibberella zeaelipase)和 FOL(尖孢镰刀菌脂肪酶,Fusarium oxysporumlipase)分别有44%和43%的序列一致性外,还分别与偏甘油酯脂肪酶PCL、PcMdL(圆弧青霉脂肪酶,Penicillium cyclopiumlipase)和AOL有42%、42%和40%的序列一致性。虽然这些RML家族脂肪酶表现出较高的同源性,但是在C末端均表现出了差异性。偏甘油酯脂肪酶在图示区域中相对于甘油三酯脂肪酶有更多氨基酸的插入。

图2 TLL脂肪酶和AOL脂肪酶的结构叠合Fig.2 The structural superimposition of TLL and AOL lipases

图3 TLL脂肪酶和突变体TLL_CC的纯化电泳图Fig.3 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis patterns of the purification of TLL and TLL_CC

另一方面,通过同源建模获得的 AOL脂肪酶模型与TLL脂肪酶的晶体结构的叠合(图2)表明,这两个具有不同底物选择性的脂肪酶的整体结构有很好的重叠性(RMSD=0.68),仅在C末端处出现了大的不重叠区,且该区域与序列比对中的氨基酸插入区吻合。为了探究该区域的差异与RML家族脂肪酶的底物选择性的关系,我们构建了 TLL脂肪酶的突变体,将AOL脂肪酶的C末端(Y246-H266)替换TLL脂肪酶的C 末端(I241-P256),该突变体被命名为 TLL_CC(图1b)。野生型TLL脂肪酶和突变体TLL_CC通过Q柱纯化获得高纯度蛋白,SDS-PAGE电泳图见图3。TLL脂肪酶的分子量大小约为35 ku,而TLL_CC的分子量略大于TLL脂肪酶,约为36 ku。经纯化后的TLL脂肪酶及突变体TLL_CC在图中对应分子量大小处有明显条带,且蛋白纯度较高。

2.2 TLL和TLL_CC脂肪酶的最适反应温度和pH

图4 温度(a)和pH(b)对TLL脂肪酶和突变体TLL_CC水解活力的影响Fig.4 Effect of temperature (a) and pH (b) on the hydrolytic activity of TLL lipase and mutant TLL_CC

从图4a可以看出TLL和TLL_CC脂肪酶在pH 7.0下的活力都随反应温度的变化呈现出抛物线的变化趋势。TLL脂肪酶的最适温度为50 ℃,而突变体TLL_CC的最适温度为35 ℃。从图4b则可以看出TLL脂肪酶和突变体TLL_CC在35 ℃、pH 4~9下的活力都随pH的增加呈现出递增的趋势。由此可见,C末端的替换使TLL脂肪酶的最适反应温度下降了15 ℃,与 AOL脂肪酶接近[19]。这可能是因为插入的氨基酸在末端形成了更长且柔性更大的无规卷曲(图2)。众所周知,酶在催化反应的时候需要一定的柔性,使之与底物稳定的结合,而较高的温度可以提供给酶分子更多的柔性。因此当酶分子本身具有较高的柔性时则仅需要较低的温度就能使酶的催化效果达到最佳。虽然该突变体的最适反应温度发生了变化,但是该区域的替换并没有太多的带电氨基酸参与(图1b中TLL序列显示仅D247为带电氨基酸),因此不会对TLL脂肪酶的电解状态产生太大的影响,从而使其pH特性并没有发生明显的变化。

2.3 TLL和TLL_CC脂肪酶的底物选择性

图5 TLL脂肪酶(a)和突变体TLL_CC(b)催化三油酸甘油酯的水解反应Fig.5 Time course of hydrolysis of triolein by TLL lipase (a) and mutant TLL_CC (b)

甘油三酯(TAG)的水解反应在35 ℃、pH 7.0的条件下进行,水解产物包含1,3-甘油二酯(1,3-DAG)、1,2-甘油二酯(1,2-DAG)、1-甘油单酯(1-MAG)、2-甘油单酯(2-MAG)以及游离脂肪酸(FFA)。结果如图5所示,当反应在24 h达到平衡时,TLL脂肪酶催化的水解反应中甘油三酯残余28.30%,仅为TLL_CC组剩余的TAG的58.81%,表明替换C端后水解甘油三酯能力变弱。但 TLL脂肪酶反应体系中残留的甘油二酯(DAG)比TLL_CC多2.27%。

而在相同温度和pH的反应条件下甘油和油酸的酯化反应中,TLL脂肪酶和突变体都在48 h到达平衡(图6)。此时,两组反应中,TLL脂肪酶催化生成的TAG含量为突变体TLL_CC的1.74倍,但其催化生成的DAG却与突变体TLL_CC相当,都约为38.90%,表明替换C端后酯化合成甘油三酯的能力也相应变弱,而甘油二酯的合成能力未受影响。以上实验结果显示,C末端的替换导致TLL脂肪酶接纳TAG型底物的能力减弱,但是依旧保留了其对DAG型底物的催化能力。这也可以解释为什么TLL脂肪酶在pH 7.0时的最佳水解活力是突变体TLL_CC的3.57倍,但是它们催化甘油和油酸酯化生成DAG的能力却相差无几。

图6 TLL脂肪(a)和突变体TLL_CC(b)催化甘油和油酸的酯化反应Fig.6 Time course of esterification of glycerol with oleic acid by TLL lipase (a) and mutant TLL_CC (b)

2.4 底物选择性调节的分子机制

为了进一步探究C末端影响TLL脂肪酶底物选择性的微观原因,构建了突变体TLL_CC的开放构象。如图7a所示,将TLL脂肪酶、AOL脂肪酶和突变体TLL_CC的空间结构叠加后发现AOL脂肪酶和突变体TLL_CC的C末端的262和257位点较TLL脂肪酶在螺旋α8(图2)的N端多出了一个疏水侧链的亮氨酸覆盖在催化活性中心上方,而TLL脂肪酶的255位的异亮氨酸在AOL脂肪酶和突变体TLL_CC中也都被苯丙氨酸取代。在TLL脂肪酶中,覆盖在其催化口袋上的I255与W97之间的距离为9.9 Å(图 7b)。而AOL脂肪酶C末端的L262和F265与盖子上的W89之间的距离为7.5 Å和8.0 Å,比突变体TLL_CC的L257和F260与W97之间的距离分别少1.3 Å和1.1 Å(图7c和d)。由此可见,AOL脂肪酶由于L262、F265与W89的位阻效应无法接纳体积较大的TAG型底物而只能接纳DAG型底物。相较而言,TLL脂肪酶不存在这样的位阻效应,其催化中心的最小宽度都已经接近10 Å,这可以使其顺利地接纳TAG型底物。虽然将AOL脂肪酶的C末端置换到TLL脂肪酶上能够加大催化口袋的位阻效应,但是由于整体结构的差异性,突变体TLL_CC在催化口袋的位阻比AOL脂肪酶小得多。这使得突变体 TLL_CC依然保留一定的TLL脂肪酶催化TAG型底物的能力,同时没有影响其接纳DAG底物的本能。

图7 TLL脂肪酶、AOL脂肪酶和突变体TLL_CC的叠合图(a)及TLL脂肪酶(b),AOL脂肪酶(c)和突变体TLL_CC(d)的表面展示图Fig.7 The superimposition of TLL lipase, AOL lipase and mutant TLL_CC (a) and surface representation of the catalytic pockets from TLL lipase (b), AOL lipase (c) and mutant TLL_CC (d)

3 结论

甘油二酯是一种具有保健功能的新型食用油脂,而单甘酯(MAG)及二酯单酯混合物是被广泛应用于食品工业中的表面活性剂,这些脂质产品都可以由偏甘油酯脂肪酶高效合成[20,21]。但是,偏甘油酯脂肪酶的数量相较于甘油三酯脂肪酶而言却十分有限。本文通过比较RML脂肪酶家族中的甘油三酯脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶的序列和空间结构,发现了这两类酶的本质差异在于靠近催化三联体中组氨酸的C末端。通过置换甘油三酯脂肪酶TLL的C末端并考察野生型TLL和突变体TLL_CC的催化特性,我们发现突变体完全保留了野生型TLL脂肪酶接纳DAG型底物的能力,但是催化TAG型底物的活力大幅下降。这使得突变体TLL_CC更像是一个偏甘油酯脂肪酶。通过结构分析发现,当C末端的I255替换成F并且在螺旋α8的N端上引入一个新的疏水氨基酸L可以增加催化口袋的位阻效应,减小催化口袋的体积,从而调节脂肪酶的底物选择性。本研究论证了TLL脂肪酶的C末端序列或结构对其底物选择性的调节作用,并构建了一种能够应用于工业生成食用型甘油二酯和甘油酯型乳化剂的新型脂肪酶。

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