枳椇4种成分对人肝细胞HL7702脂肪变性的抑制作用

杜瑞雪，汪锐，李善姬

(1.吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林 132013)(2.延边大学医学院，吉林延吉 133002)

酒精性肝病（alcoholic liver disease）是肝脏内脂肪过度沉积导致的肝脏疾病，长期大量喝酒是该病发生的直接原因，早期表现为脂肪肝、酒精性肝炎，如能严格戒酒，进行保肝治疗，肝脏病变可以逆转，如果任由其发展为肝纤维化和肝硬化，则难以逆转[1]。所以在酒精性肝病的早期阶段尽早治疗，阻止肝脏病变的进一步扩展。酒精性肝病多发生于西方国家，随着人们生活水平的提高，社交的需要和传统的“酒文化”导致我国脂肪肝发病率呈逐年上升的趋势，其危害性已经不可小觑，酒中的乙醇在肝脏代谢成为乙醛，大量蓄积可引起肝细胞坏死和纤维化。轻中度患者恶心、肝区隐痛，肝肿大和腹水，重度患者可发生食管静脉曲张破裂出血，肝性脑病等。我国很多学者也已经对该疾病的进行深入研究，但由于酒精性脂肪肝的发病机制较为复杂涉及生理、生化、免疫和遗传等众多学科，研究进展较为缓慢，治疗效果不尽如人意。

枳椇（Hovenia acerba）为鼠李科枳椇属植物（Rhamnacea genus），是我国公布的药食两用中药，果实甘甜，枳椇子可入药。在古代《唐本草》、《本草纲目》等多部医药著作中都对其解酒功效有具体的记载，并且现代的众多药理实验研究表明枳椇属植物含皂苷、黄酮和生物碱等解酒成分，其中以二氢杨梅素和黄酮类化合物中的槲皮素效果显著。中药的应用时间长久且毒副作用小，疗效优于西药[2,3]，研究表明枳椇提取物有缓解酒精肝脂肪变性和炎症，保护肝脏损伤的作用[4～7]，谢立等[8]证明了枳椇乙酸乙酯层的有效成分含量高于其他提取层，也有实验证实了二氢杨梅素的解酒作用[9,10]。课题组在前期研究中证明了枳椇乙酸乙酯提取层的解酒作用，故本实验着手于枳椇乙酸乙酯层的4种单体（槲皮素、柚皮素、杨梅素、二氢杨梅素）来筛选解酒保肝的有效成分，为进一步研究和开发有解酒保肝作用的保健食品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肝脏HL7702细胞株，武汉普诺赛生命科技有限公司；二氢杨梅素、槲皮素、柚皮素、杨梅素，中国医学科学研究院药物研究所；RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜，美国GIBCO公司；油红O，中国医药（集团）上海化学试剂公司；TG、ALT、AST检测试剂盒，上海岚派生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；恒温二氧化碳培养箱，Thermo；全自动酶标仪，Olympus；倒置生物显微镜，Olympus。

1.3 实验方法

1.3.1 人肝细胞HL7702培养及MTT法筛选乙醇最佳诱导浓度

细胞培养所用培养基为含 10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。细胞以1×105个/mL接种于96孔培养板，待细胞长满孔底加入配好的乙醇工作液（终浓度为0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、2.4%、3.6%），继续培养48 h，吸出上清液，每孔加30 μL（5 mg/mL）MTT，置培养箱内培养4 h后吸去孔内上清液，每孔加入150 μL DMSO，全自动酶标仪于波长570 nm检测各孔吸光度值（A），同时设置调零孔（培养基、MTT、DMSO）、对照孔（细胞、培养基、MTT、DMSO）。

1.3.2 饱和油红O观察酒精性脂肪肝体外造模

将乙醇用RPMI-1640培养液稀释浓度为0.6%、0.9%、1.2%的工作液，取对数生长期细胞于24孔板培养，加入不同浓度乙醇工作液，继续培养48 h，吸去旧培养液。用1 mL PBS缓冲液轻缓低漂洗3次，加4%多聚甲醛固定30 min。把饱和油红O及去离子水按照以下比例制成油红O稀释液，饱和油红O:去离子水=3:2，静置10 min左右，滤膜过滤备用。每孔加500 μL油红O稀释液覆盖孔板底部，避光染色1 h，纯净水漂洗三次，除去多余染料，倒置显微镜观察。

1.3.3 MTT法筛选四种成分对乙醇造模前后细胞活性的影响

实验分为正常对照组 N（含 10%胎牛血清的RPMI-1640培养液、细胞）；乙醇模型组E（0.9%酒精浓度工作液、含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液、细胞）；枳椇不同提取部位乙酸乙酯层4种成分（二氢杨梅素A、槲皮素B、柚皮素C、杨梅素D）的高、中、低剂量实验组（相当于4 mg/mL、3 mg/mL和2 mg/mL的枳椇生药、0.9%酒精浓度工作液、含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液、细胞）。取对数生长期细胞于96孔板，置于37 ℃、5% CO2孵育箱培养24 h，加入预先配置的工作液，每孔100 μL，设10个平行孔。继续培养48 h后，加入MTT于培养箱培养4 h，再加入DMSO，酶标仪检测吸光度。

1.3.4 检测肝酶ALT、AST和细胞内TG含量

取对数生长期细胞于24孔板培养24 h，0.9%乙醇工作液干预48 h，加入不同浓度药物继续干预48 h，收集细胞。按照试剂盒操作说明检测肝酶ALT、AST和细胞内TG的含量。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学处理，实验数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较先检验正态性和方差齐性，若方差齐，采用单因素方差分析，若不齐采用单因素ANOVA两两比较。选定p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 MTT筛选乙醇诱导的最佳浓度

表1 不同浓度乙醇作用于HL7702肝细胞后细胞的活性情况Table 1 The HL7702 cells activity change by different concentration ethanol

MTT法筛选乙醇造模的最佳诱导浓度，酶标仪检测吸光度，计算细胞活性变化，结果见表 1。当乙醇浓度为0.9%时，体外造模效果最好。由表1结果可知，与对照组相比，乙醇浓度为0.3%、0.6%时，细胞活性在100%以上，OD值较对照组稍增高，显微镜下观察这两种浓度下细胞形态，细胞形态和对照组相比无明显改变，生长良好，当乙醇浓度为0.9%、1.2%时，细胞活性分别为95.62%、85.01%，OD值与对照组相比稍下降，细胞形态稍有增大，生长正常；当乙醇浓度为2.4%、3.6%时，细胞活性在80%以下，OD值与对照组相比下降较明显，肝细胞体积明显增大，细胞存活率也明显下降。根据 MTT检测结果、细胞活性变化再结合显微镜下细胞形态学观察，可以选择乙醇浓度为0.9%或1.2%工作液建立脂肪肝模型进行接下来药物筛检工作。

2.2 观察乙醇造模后细胞内的脂滴情况

油红O染色观察发现用0.9%乙醇体外造模脂肪肝细胞效果最好，细胞肿胀变圆，脂肪颗粒清晰可见。正常对照组细胞形态正常，生长状态良好，胞浆内无明显脂滴形成；乙醇组细胞形态有不同程度的改变，细胞肿胀明显，细胞内有橘红色脂滴形成。0.9%浓度乙醇组细胞内脂滴颗粒呈连珠状排列，界限清楚且分布均匀；1.2%浓度乙醇组细胞内也有较多脂滴颗粒，但是分布不均匀，排列杂乱无序脂滴颗粒之间界限模糊，部分细胞出现胞膜破裂，细胞脱壁现象也明显。为提高实验的准确性，减少干扰因素，故结合表1实验结果，本试验最终选用浓度0.9%乙醇进行体外酒精性脂肪肝造模。

2.3 四种成分对乙醇造模细胞的影响

表2 4种成分对乙醇造模细胞的影响Table 2 The Effects of 4 components on ethanol model cells

四种成分干预造模后细胞，MTT法检测药物对细胞的存活率影响，结果见表2。由表2结果可知，二氢杨梅素和槲皮素干预造模细胞的存活率为94%～95%，OD值与对照组相比略有下降但与模型组相比略有上升，说明这两种药物对体外酒精性脂肪肝细胞的效果明显。与对照组相比，枳椇乙酸乙酯层 4种单体对酒精性脂肪肝模型进行干预，二氢杨梅素和槲皮素干预细胞后整体活性高于模型组，而柚皮素对细胞活性几乎无影响；组内比较，二氢杨梅素与槲皮素干预脂肪肝模型，随着药物剂量的增加细胞活性呈相对增加趋势，杨梅素只有高剂量组对细胞活性有微弱影响，柚皮素几乎无变化。

2.4 药物干预后细胞内TG含量检测

检测药物干预造模细胞后TG含量的变化，结果见表 3。细胞内甘油三指的含量是检测脂肪肝的一项重要指标，造模细胞的TG含量增加，二氢杨梅素和槲皮素干预脂肪肝细胞，TG含量相对减少，说明二氢杨梅素和槲皮素可以缓解脂肪肝细胞内甘油三酯的代谢紊乱。由表3结果可知，模型组TG含量为0.28 mmoL/L，相比对照组0.07 mmoL/L增加，差异有统计学意义（p＜0.05），与模型组比较，除柚皮素和杨梅素的低剂量组外，其他各组细胞内甘油三酯的含量有显著差异（p＜0.05）。组内比较发现，二氢杨梅素高剂量组细胞内甘油三酯含量为0.15 mmoL/L，低于中低剂量组，说明随药物浓度增加，细胞内甘油三酯的含量减少，合成受到抑制，而其他组的差异不明显。由此可知，二氢杨梅素有抑制细胞内TG合成的作用，且比槲皮素、柚皮素和杨梅素的效果好。

表3 各单体干预人正常HL7702肝细胞后TG含量Table 3 The content of TG in HL7702 cells by four monomers（±s, n=5, mmoL/L）

表3 各单体干预人正常HL7702肝细胞后TG含量Table 3 The content of TG in HL7702 cells by four monomers（±s, n=5, mmoL/L）

注：a表示模型组与对照组相比，p＜0.05；b表示与模型组相比，p＜0.05；c表示与各组高剂量相比，p＜0.05。下表同。

组别 TG含量N 0.07±0.05 E（0.9%乙醇） 0.28±0.00a E+A高剂量组 0.15±0.01b中剂量组 0.18±0.00bc低剂量组 0.21±0.01bc E+B高剂量组 0.18±0.01b中剂量组 0.18±0.02b低剂量组 0.19±0.02b E+C高剂量组 0.26±0.02b中剂量组 0.27±0.005b低剂量组 0.27±0.02c E+D高剂量组 0.26±0.01b中剂量组 0.27±0.01bc低剂量组 0.27±0.01

2.5 药物干预后细胞肝酶ALT、AST 泄漏量检测

表4 各单体干预细胞后肝酶ALT、AST泄漏量Table 4 The leakage of ALT, AST on HL7702 by four monomers（±s, n=5, mmoL/L）

表4 各单体干预细胞后肝酶ALT、AST泄漏量Table 4 The leakage of ALT, AST on HL7702 by four monomers（±s, n=5, mmoL/L）

组别 ALT含量 AST含量N 4.56±0.01 14.19±0.00 E（0.9%乙醇） 9.79±0.01a 22.26±0.01a E+A 高剂量组 6.56±0.00b 17.15±0.01b中剂量组 7.06±0.00bc 17.95±0.04bc低剂量组 7.45±0.00bc 18.25±0.01bc E+B 高剂量组 7.33±0.01b 17.64±0.04b中剂量组 7.34±0.01b 17.71±0.02b低剂量组 7.36±0.01bc 17.84±0.01bc E+C 高剂量组 9.68±0.02b 21.84±0.02b中剂量组 9.71±0.01b 21.92±0.02bc低剂量组 9.73±0.01b 21.98±0.01bc E+D 高剂量组 9.28±0.00b 21.71±0.07b中剂量组 9.29±0.00bc 21.81±0.04b低剂量组 9.32±0.00bc 21.95±0.01b

检测药物干预造模细胞 ALT、AST泄漏量的变化，结果见表4。肝酶ALT、AST含量与肝损伤有关，泄漏量越多肝损伤越明显，结果显示，模型组ALT、AST泄漏量明显升高，二氢杨梅素和槲皮素干预脂肪肝细胞，ALT、AST泄漏量下降明显。由表4结果可知，模型组细胞的肝酶ALT、AST泄漏量分别为9.79 mmoL/L和22.6 mmoL/L，相比对照组4.56 mmoL/L和14.19 mmoL/L明显升高，有显著差异（p＜0.05）；与模型组比较，各药物干预组的肝酶泄漏量均有显著差异（p＜0.05），其中效果最好的是二氢杨梅素高剂量组，ALT泄漏量为6.56 mmoL/L，AST泄漏量为17.15 mmoL/L；与高剂量组相比，二氢杨梅素和杨梅素中低剂量的 ALT泄漏量升高，差异有统计学意义（p＜0.05），二氢杨梅素和柚皮素中低剂量AST升高，差异有统计学意义（p＜0.05），综合比较，二氢杨梅素抑制肝细胞内ALT、AST泄漏量效果最好。

3 结论

3.1 肝脏是人体的重要解毒器官，酒精的代谢过程（90%～95%）主要在肝脏进行，当长期大量摄入酒精，超出肝脏的解毒能力，就会导致机体内重要的生理生化代谢失衡，严重损伤肝细胞，导致酒精性脂肪肝。枳椇作为传统解酒良药，一直发挥它的有效作用，研究表明[3]中国传统解酒良方枳椇云母汤可以通过清除自由基、抗脂质过氧化、降低肝组织中细胞因子的表达起到保肝作用。

3.2 合理利用枳椇解酒护肝中的有效成分并进行提取分离成为现代研究的新思路，本课题组前期实验确定了枳椇乙酸乙酯层的解酒效果最佳，因此本次研究从乙酸乙酯层提取了4种成分，分别为二氢杨梅素、槲皮素、柚皮素和杨梅素，通过建立体外酒精性脂肪肝模型，药物干预，检测药物对模型细胞的抑制率，观察药物干预前后细胞内脂肪颗粒的变化，检测细胞TG、ALT、AST含量变化，来筛选枳椇乙酸乙酯层中解酒保肝的有效成分。

3.3 实验结果表明，二氢杨梅素的解酒效果最佳，潘仁奇[9]等人对二氢杨梅素解酒作用的研究表明，二氢杨梅素能延长醉酒小鼠的耐受时间，并能明显地缩短醒酒的时间，证实二氢杨梅素有较好的防醉解酒效果，与本次研究结果一致，在今后的保健食品及其相关产品开发中，考虑其解酒的药效作用，为产品开发提供理论依据。