香杞平脂咀嚼片的降脂作用

陆敏 ，常晓婕 ，张文晋 ，2，刘宁 ，2，杨佳美 ，2，刘艳华 ，2，马学琴 ，2，杨建宏 ，2，余建强 ，2，李凤梅 ，2

（1.宁夏医科大学药学院，宁夏银川 750004）（2.宁夏回药现代化工程技术研究中心,宁夏回医药协同创新中心,宁夏药物创新与仿制药研究重点实验室，宁夏银川 750004）

随着人民生活水平的提高以及人们不良生活习惯的影响，高脂血症的发生率呈逐年上升的趋势，据2012年全国调查[1,2]结果显示，中国成人血脂异常总体患病率高达 40.4%，其中，高低密度脂蛋白血症患病率为33.9%；高甘油三酯血症为13.1%；高胆固醇血症为4.9%。

血脂[3,4]是对血浆中所含脂类的统称，主要包括三酰甘油（TG）、胆固醇及其酯（即总胆固醇，TC）、磷脂（PL）以及游离脂肪酸（FFA）等，这些脂类与血浆中的载脂蛋白结合形成乳糜微粒[5]（CM）、极低密度脂蛋白（VLDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C），在血浆中运输和代谢。当机体在一些内外因素的作用下发生脂质代谢异常，主要表现为LDL水平升高和HDL水平降低时，导致血脂水平升高并超过正常值，即为高脂血症（hyperlipidemia）。高脂血症是中老年人群的多发疾病，可引起多种严重并发症，包括动脉粥样硬化、心肌梗死、脑卒中等一系列心脑血管疾病，这些疾病都是导致人类死亡的主要原因[6]。

研究表明，枸杞可有效降低血清中 TG、TC、LDL-C含量及LDL-C/HDL-C(高密度脂蛋白)比值，具有明显的降血脂作用[7]；仙人掌可降低高脂血症小鼠血清TC、TG含量及AI水平，明显升高HDL-C含量[8,9]；胡芦巴能显著降低大鼠血清TG、TC、LDL-C水平[10]。关于枸杞、仙人掌和葫芦巴这三种植物的复方，还未见报道，宁夏医科大学药学院首次将这三种植物进行科学组方，通过制备工艺研究出香杞平脂咀嚼片（Xiang Qi Lower Blood Lipids Chewable Tablet），已经完成含量测定。本实验的目的旨在通过建立高脂血症小鼠模型，初步探究香杞平脂咀嚼片对实验性高脂血症小鼠的预防作用，为开发新的平脂产品提供支持，同时也为香杞平脂咀嚼片合理使用提供初步指导。

1 材料与方法

1.1 原料

1.1.1 实验动物及高脂饲料

实验动物：SPF级健康雄性小鼠60只，体重22±2 g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（宁）-2016-0001。

高脂饲料配方：胆固醇 1.0%、实验动物预混料2.0%、磷酸氢钙 2.0%、大豆分离蛋白 10.0%、猪油12.0%、蔗糖20.0%、维持鼠料53.0%，购于江苏省协同医药生物工程有限责任公司。

1.1.2 药物、主要试剂及仪器

香杞平脂咀嚼片，宁夏医科大学药学院联合宁夏回药现代化工程技术研究中心共同研制，所用辅料皆为食品级别；辛伐他汀片，国药集团汕头金石制药有限公司（171101，20 mg/片）；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，天津光复精细化工有限公司；生理盐水，山东齐都药业有限公司；总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG) 试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒都购自南京建成生物工程研究所；AL104电子天平，METTLER TOLEDO；TD5K低速离心机，长沙东旺实验仪器公司；酶标仪，THermo 1510-00655C；DK-S24型恒温水浴锅，上海精宏实验设备公司；其余试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 香杞平脂咀嚼片的制备

采用湿法制粒，将枸杞子提取物、仙人掌提取物、葫芦巴提取物（由于主药具有强吸潮性，要保证制粒车间的温湿度不宜过高）与β环糊精等辅料按比例混合均匀，使用75%乙醇进行制软材，过14目筛，50 ℃干燥2 h，整粒，添加1%硬脂酸镁混合均匀后压片得到香杞平脂咀嚼片。

1.2.2 香杞平脂咀嚼片最大耐受量的测定

采用一次最大限量法，SPF级ICR (20±2) g小鼠40只，雌、雄各半，适应实验环境2～3 d。禁食不禁水12 h后，随机挑选20只(雌、雄各半)按给药量2 g/kg，给药体积0.4 mL/10 g经口一次给药，另20只给予同体积的蒸馏水，连续观察7 d，记录小鼠的毛发、中毒症状及死亡情况。

1.2.3 动物分组及给药

选用健康雄性SPF级ICR小鼠(22±2) g，60只，于适应性喂养1周后随机分为6组：正常对照组，以下简称正常组；模型组；模型+辛伐他汀组；模型+香杞平脂咀嚼片（2 g/kg、1 g/kg、0.5 g/kg）剂量组，以下简称香杞片高、中、低剂量组；于实验前一天给小鼠禁食不禁水12 h，于每天早晨8:00～9:00灌胃给药。除正常组饲喂普通饲料外，其余各组均饲喂高糖高脂饲料。同时，给药组每日分别灌胃香杞片 2 g/kg、1 g/kg、0.5 g/kg（溶剂用生理盐水）；辛伐他汀5 mg/kg（溶剂用0.5% CMC-Na溶液），正常组和模型组每日给予同体积生理盐水，每次用药体积均按0.2 mL/10 g计算，各组灌胃1次/d，连续灌胃6周。每周记录一次小鼠体重，观察饮食对小鼠体重的影响。

1.2.4 指标测定

每周记录一次小鼠体重。末次给药禁食不禁水12 h后各组小鼠摘除眼球取血，4 ℃冰箱静置30 min后将血样低温离心，3500 r/min，离心15 min，分离血清，密封，-20 ℃冷存待检。采用试剂盒检测血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平。

1.2.4.1 血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的检测

按照生化指标测试试剂盒说明书操作，所有小鼠血清检测过程避免反复冻融和长时间保存降低酶活力，在取样当天即开始检测，若样品蛋白浓度过高，必要时做适当浓度稀释后测定。

磷酸甘油氧化酶法(GPO/PAP酶法)测定血清中TG含量，在510 nm处测定吸光度，含量计算方法如下式（1）；COD/PAP酶法测定血清中TC含量，在510 nm 处测定吸光度，含量计算方法如下式（2）；直接法测定血清中LDL-C含量，在546 nm处测定吸光度，含量计算方法如下式（3）；直接法测定血清中HDL-C含量，在546 nm处测定吸光度，含量计算如下式（4）。

1.2.4.2 血清中ALT、AST活力的检测

按照生化指标测试试剂盒说明书操作，所有小鼠血清检测过程避免反复冻融和长时间保存降低酶活力，在取样后立即开始检测。

微板法测定血清中ALT活力，严格按照试剂盒操作进行，先做ALT标准曲线，在510 nm测定各孔OD值，各孔吸光度减零孔吸光度，所得差值等于绝对OD值（=测定孔OD值-对照孔OD值）作为横坐标，相应的卡门氏单位为纵坐标，作坐标图拟合公式；按试剂盒操作在510 nm处测定各孔OD值，以绝对OD值为最终数值，查标准曲线，求得相应的ALT活力单位。

微板法测定血清中AST活力，严格按照试剂盒操作进行，先做AST标准曲线，在510 nm测定各孔OD值，各孔吸光度减零孔吸光度，所得差值等于绝对OD值（=测定孔OD值-对照孔OD值）作为横坐标，相应的卡门氏单位为纵坐标，作坐标图拟合公式；按试剂盒操作在510 nm处测定各孔OD值，以绝对OD值为最终数值，查标准曲线，求得相应的AST活力单位。

1.2.5 数据统计分析

实验数据采用SPSS 22.0统计软件进行处理，计量结果均以均数±标准差(x±s)表示，“n”表示“每组小鼠只数”，采用单因素方差分析（One-way-anova）多组均数间的两两比较采用LSD-t检验，以p<0.05判断为有显著性差异，p<0.01为有极显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 香杞平脂咀嚼片最大耐受量的测定

实验期间小鼠无任何不良症状，饮食、饮水、毛发及活动均正常，且未出现死亡，根据最大耐受量的判定，给予小鼠药物的最大溶解度和最大给药体积时小鼠未出现死亡的情况下，最大耐受量大于最大给药量，则小鼠对香杞平脂咀嚼片的最大耐受量大于 2 g/kg。

2.2 香杞平脂咀嚼片对高脂血症小鼠体重影响

整个实验周期内各组小鼠增加的体重在 18～19 g不等，各组间没有差异（p>0.05），说明在给药期间各组小鼠生长良好，给药行为未对小鼠造成不良反应。香杞平脂咀嚼片对高脂血症小鼠体重的影响结果见表1。

表1 香杞平脂咀嚼片对高脂血症小鼠体重的影响Table 1 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on body weight of hyperlipidemia mice (±s, n=10)

表1 香杞平脂咀嚼片对高脂血症小鼠体重的影响Table 1 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on body weight of hyperlipidemia mice (±s, n=10)

注：与正常组比较，*表示差异有显著性（p<0.05），**表示差异有极显著性（p<0.01）；与模型组比较，#表示差异有显著性（p<0.05），##表示差异有极显著性（p<0.01）。

组别 增加的体重/g正常组 18.73±3.28模型组 19.24±4.05模型+辛伐他汀(5 mg/kg) 18.31±2.52模型+香杞片(2 g/kg) 18.20±2.75模型+香杞片(1 g/kg) 19.70±3.818模型+香杞片(0.5 g/kg) 18.27±4.13

2.3 香杞平脂咀嚼片对高脂血症小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的影响

由表2数据可知：与正常组相比，模型组TC显著升高（p<0.05），TG极显著降低（p<0.01），LDL-C极显著升高（p<0.01），说明此高脂饲料能够升高TC和LDL-C但是对HDL-C影响不大，并且降低模型组TG[11]的原因可能是小鼠进食脂肪过多，吸收过少造成肝损伤。并且香杞片高、中和低剂量组TG与正常组相比较差异无统计学意义（p>0.05），表明香杞片具有能够使高脂血症小鼠TG恢复正常的作用。与模型组相比，阳性药TC极显著降低（p<0.01）、LDL-C显著降低（p<0.05），但阳性药对TG和HDL-C的变化无统计学意义，可能是样本量过少的原因。香杞平脂咀嚼片的高、中和低剂量均能降低TC和LDL-C，差异具有统计学意义（p<0.01或p<0.05），且高剂量组能够显著升高HDL-C（p<0.05），各组对TC的降低幅度分别为25.75%、28.85%、12.23%，对LDL-C的降低幅度为37.90%、34.67%、2.42%，对HDL-C的升高幅度分别为73.70%、17.24%、3.92%。结果可知香杞平脂咀嚼片能够有效改善高脂血症小鼠血脂。

孙国栋[10]和卢芙蓉等[12]研究的葫芦巴提取物降低了TG、TC和LDL-C但对HDL-C无明显影响；饶颖竹等[13]对仙人掌的研究结果显示降低了TC、TG，升高HDL-C；韦唯[14]将枸杞和沙棘进行复配制备保健品，其中高剂量组降低TC和TG的幅度分别为25.40%和24.50%，升高HDL-C的幅度为18.70%，与之相比，香杞平脂咀嚼片能够降低37.90%的LDL-C并能增加73.70%的HDL-C。以上研究结果显示葫芦巴、仙人掌和枸杞分别具有降血脂作用，而本研究将枸杞、仙人掌和葫芦巴科学搭配在一起，进行取长补短，研究结果也显示香杞平脂咀嚼片能够多方面调控血脂。

表2 香杞平脂咀嚼片对高脂血症小鼠血脂水平的影响Table 2 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on blood lipid levels in hyperlipidemia mice (±s, n=10)

表2 香杞平脂咀嚼片对高脂血症小鼠血脂水平的影响Table 2 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on blood lipid levels in hyperlipidemia mice (±s, n=10)

注：与正常组比较，*表示差异有显著性（p<0.05），**表示差异有极显著性（p<0.01）；与模型组比较，#表示差异有显著性（p<0.05），##表示差异有极显著性（p<0.01）。

组别 TG/(mmol/L) TC/(mmol/L) HDL-C/(mmol/L) LDL-C/(mmol/L)正常组 1.29±0.31 4.87±1.48 2.39±0.60 0.52±0.17模型组 0.81±0.17** 10.33±1.44* 2.32±0.60 1.24±0.24**模型+辛伐他汀(5 mg/kg) 0.92±0.20 6.29±1.29## 3.23±1.06 0.79±0.30#模型+香杞片(2 g/kg) 1.01±0.26## 7.67±0.91# 4.01±0.86# 0.77±0.14##模型+香杞片(1 g/kg) 1.04±0.28# 7.35±1.99# 2.72±0.99 0.81±0.37##模型+香杞片(0.5 g/kg) 1.07±0.21# 9.06±0.94 2.10±0.67 1.21±0.63

2.4 香杞平脂咀嚼片对小鼠肝功能的影响

图1 香杞平脂咀嚼片对高脂血症小鼠AST的影响Fig.1 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on Liver Function in Mice with AST (±s, n=10)

实验结果可得，与正常组相比：模型组小鼠血清中ALT、AST明显升高，差异具有统计学意义（p<0.01或p<0.05），表明长期饲养此高脂饲料会对小鼠的肝脏造成严重损害。与模型组相比：辛伐他汀组能够极其显著的降低 AST和 ALT，差异具有统计学意义（p<0.01），表明阳性药辛伐他汀能够极其有效的保护肝损伤；而香杞平脂咀嚼片高和中剂量组能够极显著降低ALT（p<0.01），各组对ALT的降低幅度分别为42.09%、39.61%、22.56%，对AST的降低幅度分别为25.08%、13.68%、6.19%。

图2 香杞平脂咀嚼片对高脂血症小鼠ALT的影响Fig.2 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on liver function in mice with ALT (±s, n=10)

研究表明枸杞[15]、仙人掌[16]和葫芦巴[10]均能够降低ALT和AST活性，具有保护肝损伤的作用。但本研究对AST影响无统计学意义（p>0.05）可能是个体差异或者样本数量过少导致，表明香杞平脂咀嚼片具有保护肝的作用。香杞平脂咀嚼片对高脂血症小鼠肝功能的影响结果见图1和图2。

3 结论

3.1 高脂血症是心脑血管疾病的重要致病因素，临床资料证实TG升高1 mmol/L，男性心脑血管疾病危险性升高14%，女性则升高37%，TC、LDL-C浓度与心脑血管疾病发病率也呈正相关，而 HDL-C则与心脑血管疾病的发病率呈负相关[17]。目前，临床上主要使用西药[18,19]进行调节血脂，这些药物有一定的降脂作用，但都有较明显的毒副作用，长期服用易造成肝脏损伤，因此，西药的副作用仍是高脂血症治疗中的一大难题。比如说，胆汁酸蟹合剂类[20]中的考来烯胺降脂药，长期使用可引发高氯酸血症，可影响脂溶性维生素（A、D、E、K）、叶酸及其他一些弱酸性药物的吸收。

3.2 本实验中，通过建立高脂血症小鼠模型，采用辛伐他汀作为阳性对照药，探究采用预防治疗的方法，验证香杞平脂咀嚼片在高脂饮食过程中对血脂的调控作用。实验研究表明，高糖高脂饮食干预只引发了血清中TC的升高，且差异有显著性（p<0.01），TG并未升高，则该实验复制的模型为高胆固醇血症模型。研究结果表明香杞平脂咀嚼片能降低高脂血症小鼠血清中TC、LDL-C，提高小鼠血清中HDL-C水平，缓解体内脂质代谢紊乱，有效抑制脂质在肝脏和动脉壁沉积。高脂血症还可并发肝脏损伤，转氨酶[21]是反映肝脏功能的一项指标，其中ALT和AST是最能反映其损伤程度的两个酶活性指标，转氨酶是人体代谢过程中必不可少的“催化剂”，主要存在于肝细胞中，当肝细胞发生炎症、坏死、中毒等，造成肝细胞受损时，转氨酶便会释放入血液里，使血清转氨酶升高。本实验研究表明，6周高糖高脂饮食并使得血清中ALT、AST转氨酶升高，可见已经造成肝细胞损伤，各组ALT、AST活力的差异有统计学意义（p<0.05或p<0.01），然而喂养了香杞平脂咀嚼片的高脂血症的小鼠转氨酶活力明显降低，证明其具有保护肝细胞的作用。

3.3 美国国家胆固醇教育计划[22]第 3次报告所提出的血脂异常防治建议方案中，均强调在药物治疗前，应先进行3～6个月的非药物治疗，主要手段包括改变不良生活方式、饮食调节、戒烟酒及运动锻炼等措施。香杞平脂咀嚼片从保健品的理念出发，旨在通过长期服用来预防高脂血症，避免动脉粥样硬化的发生，从而降低心血管疾病发生的风险。目前针对香杞平脂咀嚼片的研究还不是很广泛，但这是我们未来的研究方向，旨在通过食疗控制疾病的发生，提高人们的生活质量。