紫甘蓝总花色苷提取物抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞的炎症反应

谭兵，庞琪期，钱波,3，王程强,3，曾榛,3，周燕园，宋家乐,3

（1.桂林医学院基础医学院，广西桂林 541100）(2.桂林医学院公共卫生学院，广西桂林 541100)

(3.广西高校预防医学重点实验室，广西桂林 541100)(4.桂林医学院药学院，广西桂林 541100）

紫甘蓝又名紫包菜、紫卷心菜、红甘蓝，属十字花科芸薹属甘蓝种甘蓝变种，通体呈紫红色，易于栽种且营养价值颇高[1]。目前，植物类花色苷由于其自身所具有的抗氧化、抗衰老、调控血脂、预防冠心病等多种生物活性而成为了营养学领域的研究热点。但目前对于花色苷的研究主要针对水果与豆科类植物中的蓝莓、樱桃、桑葚[2～5]及黑豆和黑米等而进行[6,7]。研究发现，紫甘蓝中富含的花青素类物质具有抗氧化、抗突变、预防心血管疾病、保护肝脏、抗肿瘤细胞等多种生理功能[8]。

炎症反应是一种非特异性免疫反应，正常水平的炎症反应是机体对抗外界刺激所做出的生理反应。但过度的炎症反应则是多种疾病发生的重要危险因素之一。属于机体免疫体系中重要免疫细胞的巨噬细胞可防止外界病原物质(细菌，病毒和真菌)的侵入[9,10]。活化后的巨噬细胞在炎症反应过程中，可通过激活自身体内的炎性介质酶如诱导型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)产生一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2)等炎症介质，诱导白介素-1β (IL-1β)，IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促炎细胞因子的分泌，使其参与到机体的免疫调节中[11]。但是，由于多种原因所引起的免疫失调而所导致机体过度分泌的炎症细胞因子会引发细胞坏死，组织损伤和退化，并因此加重炎症，从而危及机体健康[12]。

国内外目前对于紫甘蓝主要在其色素提取工艺、色素抗氧化能力等方面有较多的研究报道。而就紫甘蓝总花色苷抗炎作用的研究鲜见报道。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是常见致病性革兰氏阴性菌细胞壁中的内毒素成分，是诱发免疫反应的主要因素[13]。因此，本实验拟利用脂多糖(1 μg/mL)诱导RAW264.7小鼠单核白血病巨噬细胞制备细胞炎症模型，以此研究紫甘蓝总花色苷对细胞炎症反应的影响，讨论其可能的机制，并为紫甘蓝的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫甘蓝采购自桂林市蔬菜科学研究所。DMEM高糖型细胞培养液、胎牛血清，美国Gibco公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，美国Sigma公司；青霉素-链霉素双抗、胰蛋白酶-EDTA消化液、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，美国 Thermo Scientific公司；Trizol试剂、OligodT18、RNase、dNTP、MLV逆转录酶，美国Invitrogen公司；ROX reference Dye和SYBR Premix Ex Taq II，大连宝生物工程公司；大肠杆菌脂多糖(LPS)，美国 Sigma-Aldrich公司；IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 试剂盒，美国 Cloud colon公司；一氧化氮(NO)和前列腺素E2 (PGE2)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

723型紫外分光光度计，上海精科实业有限公司；EYELA N-1001S旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社；三洋 MCO-15AC二氧化碳细胞培养箱，日本三洋公司；Centrifuge 5418R冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Biotek Elx808酶标仪，美国Bio-Tek公司；FLUOstar OPTIMA荧光酶标仪，德国BMG公司。Quant Studio TM 6 Flex PCR仪，美国Applied Biosystems公司。

1.3 实验细胞株

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株 RAW 264.7购自中国科学院昆明细胞库(编号：KCB200603 YJ)。

1.4 紫甘蓝总花色苷的制备

新鲜紫甘蓝的可食部清洗除杂后，真空冷冻干燥，粉碎，过60目筛备用。紫甘蓝粉(10 g)中加入200 mL酸化乙醇溶液(80% V/V，pH 3.0)后在室温条件下搅拌浸提5 h。滤液经3000×g离心15 min后弃渣收集上清，30 ℃真空减压旋转蒸发制备浓缩提取物。使用D-101大孔树脂吸附浓缩液，并用去离子水反复冲洗树脂除杂数次后。使用前述酸化乙醇溶液注入大孔树脂中吸附目标产物1 h，收集液体，30 ℃真空减压旋转蒸发制备浓缩提取物，最终制成紫甘蓝总花色苷提取物(RCTA)，-80 ℃储存待用。

1.5 紫甘蓝提取物中总花色苷浓度的测定

在具塞比色管中加入4.5 mL的KCl-HCl缓冲液(25 mmol/L，pH 1.0)或4.5 mL的醋酸钠-醋酸缓冲液(400 mmol/L，pH 4.5)后，分别加入0.5 mL的紫甘蓝总花色苷提取物，室温放置20 min。分别测定530 nm和700 nm处的吸光度后，依照公式：A=(A530-A700)pH1.0-(A530-A700)pH4.5计算总花色苷的吸光度。然后依照公式总花色苷浓度(mg/mL)=A×Mw×DF/ε×L 计算实际样品中的花色苷浓度。其中 Mw为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔质量(449.2 g/mol)；DF为稀释因子(10)；ε是矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔吸收系数[26900 L/(mol·cm)]；L为比色杯光程(1 cm)。经该法测定提取物中总花色苷含量为174.35±4.29 mg/g。

细胞接种到6孔板并按1.6.1方法分组处理，细胞浓度调节为2×105个/mL，每孔2 mL，进行24 h培养后，以不同质量浓度的紫甘蓝总花色苷提取物(1 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL)作用细胞，设置空白对照组、LPS组及LPS+紫甘蓝总花色苷提取物组，继续培养24 h。在4 ℃下收集细胞培养上清液。取适量培养上清液按照TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8测定试剂盒说明书步骤操作。

1.6 紫甘蓝总花色苷提取物对细胞炎症的作用

1.6.1 细胞培养及分组

1.6.4 qRT-PCR法测定 RAW264.7细胞内iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-8的mRNA表达

RAW264.7细胞用DMEM细胞培养液(含10%FBS与1%青-链霉素双抗液)置于37 ℃、5% CO2环境下湿化培养。待细胞贴壁长至培养皿80%时，用胰蛋白酶-EDTA液按比例消化传代，取指数期细胞用于实验。以DMEM培养液(含LPS：1 μg/mL)处理细胞24 h制备细胞模型。模型细胞以紫甘蓝总花色苷提取物(1 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL)继续培养24 h并进行后续实验。对照组为未经过任何处理的正常RAW264.7细胞。

1.6.2 RAW264.7细胞分泌NO和PGE2水平的检测

细胞按照前述方法分组处理并将细胞浓度调节为2×105个/mL接种于24孔板，每孔接种1 mL，进行24 h培养后，以不同质量浓度的紫甘蓝总花色苷提取物(1 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL)处理细胞，设置空白对照组、LPS组及LPS+紫甘蓝总花色苷提取物组，每组4个复孔，24 h后，按试剂盒说明书操作测定细胞培养基中NO和PGE2的含量。

按 1.6.1方法分组处理并将细胞浓度调节为2×105个/mL接种于6孔板，每孔2 mL，进行24 h培养后，同时以不同质量浓度的紫甘蓝总花色苷提取物(1 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL)作用细胞，设置空白对照组、LPS组及LPS+紫甘蓝总花色苷提取物组，继续培养24 h。12000 r/min离心5 min，弃上清，Trizol试剂盒法提取细胞内总RNA，紫外分光检测提纯后的RNA浓度用于后续实验。取总RNA(2 μg)加入 dNTPs(1 μL)、OligodT18 引物(1 μL)、MLV 逆转录酶(1 μL)、RNases抑制剂(1 μL)及 5×Buffer (10 μL)逆转录成 cDNA。取适量cDNA(2 μL)用 qRT-PCR 法检测 iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表达水平。在总反应体系中(20 μL)加入上游和下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq II (10 μL)、50×ROX reference Dye(0.4 μL)和灭菌双蒸水(5.6 μL)，充分混匀后置于PCR仪中反应。扩增反应条件为 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环，72 ℃延伸2 min。每个基因cDNA样本平行扩增3次，取Ct值均数，依公式计算目的基因表达量各引物序列见表1。

表1 引物序列表Table 1 Sequences of primers

1.6.3 模型细胞中细胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌水平的测定

1.7 数据处理与统计分析

本研究中，所有实验均重复 3次，结果以均值(means)±标准偏差(SD)表示。所得实验数据运用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析与统计处理，p＜0.05为具有统计差异。

2 结果与讨论

2.1 紫甘蓝总花色苷对 LPS处理 RAW264.7细胞分泌NO和PGE2水平的影响

图1 紫甘蓝总花色苷对LPS诱导RAW264.7细胞分泌NO和PGE2水平的影响Fig.1 Effects of RCTA on NO and PGE2 levels in LPS treated RAW264.7 cells

如图1示，与正常组相比，RAW264.7细胞在经LPS(1 μg/mL)处理后细胞分泌NO和PGE2的释放量显著升高(p＜0.05)。与 LPS组相比，紫甘蓝总花色苷提取物各组均能显著抑制 LPS处理所引起的NO与PGE2水平的释放。NO是人体内信号传导的重要分子，能参与细胞间、细胞内以及神经和心血管系统的生理调节。在炎症反应中，NO具有一定的毒性作用，不仅能够损伤DNA还参与NO介导的组织损伤作用，导致水肿和血渗出[14]。图 1所示，LPS刺激组的RAW264.7细胞中NO浓度显著高于正常对照组。而在紫甘蓝总花色苷提取物作用组中、高剂量（10 μg/mL和50 μg/mL）组的NO释放浓度显著低于LPS模型组(抑制率分别为 36.11%和 58.51%)。PGE2也是一种常见的炎症介质，其参与关节炎、结肠炎（癌）和肝炎（癌）等疾病过程中的多种炎症反应。相反，抑制PGE2的产生可减轻炎症症状[15]。经紫甘蓝总花色苷提取物作用模型细胞后，细胞 PGE2的溢出水平均得到显著抑制。紫甘蓝总花色苷提取物(10 μg/mL和50 μg/mL)处理后细胞PGE2溢出水平分别较未经处理LPS模型细胞分泌水平降低29.58%和46.26%上结果说明，紫甘蓝总花色苷提取物能够有效抑制 LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型分泌NO和PGE2水平，具有较好抗炎效果。

2.2 甘蓝总花色苷提取物对 LPS处理RAW264.7细胞中iNOS和COX-2的mRNA转录水平的影响

图2 紫甘蓝总花色苷对LPS诱导RAW264.7细胞中iNOS和COX-2的mRNA表达水平影响Fig.2 Effects of RCTA on mRNA expression of iNOS and COX-2 in LPS treated RAW264.7 cells

iNOS在炎症和免疫反应刺激下，通过催化L-精氨酸并进行氧化脱氨作用最终导致 NO的产生。而COX-2是参与PGE2生物合成的关键酶，在炎性因子介导下COX-2表达会异常增高[16]。如图2示，与LPS组相比，紫甘蓝总花苷提取物各组均能显著抑制iNOS和COX-2的mRNA表达。较未经紫甘蓝总花色苷提取物处理过的LPS模型组细胞而言，紫甘蓝总花色苷提取物(10 μg/mL和50 μg/mL)能够分别有效降低LPS模型细胞中iNOS的转录水平40.37%和65.80%。同时，紫甘蓝总花色苷提取物还能显著抑制LPS模型细胞中COX-2的转录水平22.47%和48.28%。抑制iNOS的mRNA转录水平，调控NO分泌水平；抑制COX-2的表达，下调 PGE2的生物合成，可在抑制致炎细胞因子表达的同时发挥抗炎效果[17]。

2.3 紫甘蓝总花色苷提取物对 LPS处理RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌水平的影响

TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8是常见的炎症细胞因子，能诱导炎症细胞迁徙、刺激炎症因子的释放、激化氧化应激反应，并直接导致炎症反应和组织损伤[18,19]。如图3示，与对照组相比，LPS(1 μg/mL)刺激可显著增加RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的分泌，差异具有统计学意义(p＜0.05)。不同浓度(1 μg/mL、10 μg/mL 和 50 μg/mL)紫甘蓝总花色苷提取物干预模型细胞，细胞内TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的分泌水平均得到显著抑制，且随着紫甘蓝总花色苷提取物浓度的增加，模型细胞上清液中各检测因子的浓度呈趋势下降。50 μg/mL紫甘蓝总花色苷提取物对模型细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌抑制效果最佳，抑制率为36.90%、73.02%、55.87%和58.46%。

2.4 紫甘蓝总花色苷提取物对 LPS处理RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA转录水平的影响

炎症细胞因子通常是由单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等多种细胞产生，起介导炎症反应的作用。当机体受到免疫应激或化学刺激时，会导致其过度分泌从而引起炎症反应或病理损伤[20]。如图4示，与LPS组相比，经紫甘蓝总花色苷提取物处理后的模型细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表达水平呈显著降低趋势(p＜0.05)。当紫甘蓝总花色苷提取物浓度达到50 μg/mL时，细胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的 mRNA表达水平分别较未处理的模型细胞相比下降65.26%、65.84%、68.16%和44.25%。

图3 紫甘蓝总花色苷对LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平的影响Fig.3 Effects of RBTA on TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-8 levels in LPS treated RAW264.7 cells

图4 紫甘蓝总花色苷对LPS诱导RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表达水平影响Fig.4 Effects of RCTA on mRNA expression of TNF-α, IL-1β,IL-6 and IL-8 in LPS treated RAW264.7 cells

3 结论

本研究以LPS所诱导的RAW264.7炎症细胞模型来研究紫甘蓝总花色苷提取物对细胞炎症反应的调控效果。实验结果证实，紫甘蓝总花色苷提取物能够抑制炎症模型细胞中炎性介质(NO和PGE2)，并同时抑制 LPS所诱发模型细胞中炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-8)的分泌，以此降低细胞的炎症反应。而从分子机制方面，紫甘蓝总花色苷能够有效的抑制模型细胞中炎性介质酶(iNOS和COX-2)的表达，并对TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等炎性因子的基因转录呈抑制调控作用。在日后的研究中，课题组将从经典的 NF-кB通路层面来探讨紫甘蓝总花色苷对细胞炎症反应的信号调控机制。