TRPV5信号通路调控尿钙重吸收机制的研究

陈仲萍 林俊 王群

[摘要]目的 探讨TRPV5信号通路如何调控尿钙的重吸收，影响尿钙的浓度，从而影响到含钙肾结石的形成。方法 将20只SD大鼠随机抽取10只进入结石组，10只进入对照组。模型构建成功后，测定大鼠24 h尿钙浓度，并采用免疫组化和实时荧光定量PCR，分别检测TRPV5及其mRNA在大鼠肾脏中的表达情况。结果 结石组大鼠24 h尿钙浓度明显高于对照组大鼠，差异有统计学意义（P<0.01）；免疫组化显示结石组大鼠肾脏组织的TRPV5蛋白表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）；实时荧光定量PCR显示TRPV5mRNA表达量低于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。结论 TRPV5表达下降或缺乏可使肾小管对钙的重吸收减少，促进含钙肾结石的形成。

[关键词]TRPV5；尿钙；肾结石

[中图分类号] R277.514 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）9（a）-0008-04

[Abstract] Objective To discuss how the TRPV5 signaling pathway regulates the reabsorption of urinary calcium， thus affecting the concentration of urinary calcium and thereby affecting the formation of calcium-containing kidney stones. Methods The twenty SD rats were randomly selected to take ten into the stone group， the others into the control group. After the success of the model building， the determination of 24 hours urinary calcium concentration in rats， and the expression of TRPV5 and its mRNA in rat kidney were detected by immunohistochemical and quantitative real time PCR. Results It was found that urinary calcine concentration of 24 hour in the stone group was significantly higher than that in the control group， the difference was statistically significant （P<0.01）. The expression of TRPV5 protein and its mRNA in the stone group were lower than in the control group， the difference was statistically significant （P<0.01）. Conclusion The decrease of TRPV5 expression or lack of TRPV5 can reduce the reabsorption of calcium in renal tubules and promote the formation of calcium kidney stones.

[Key words] TRPV5； Urinary Calcium； Kidney Stone

泌尿系结石是泌尿系统的常见病、多发病，由多种因素共同作用所致，尿钙增高容易诱发或促进含钙尿路结石的形成。TRPV5是一种具有高度选择性的受体活化性离子通道，并受钙离子的反馈调节。其作为介导钙离子跨细胞膜轉运的通道，在调控尿钙水平中发挥关键作用，但其具体的调控机制仍不清楚。本研究通过研究TRPV5信号系统是否参与影响尿钙的重吸收，从而影响尿钙的浓度，进而影响到含钙肾结石的形成，为进一步防治含钙肾结石提供新的思路。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物分组 SD大鼠20只，体重约150 g，购于福建医科大学实验动物中心[许可证号：SCXK（闽）2012-0001]。随机抽取10只大鼠进入结石组，10只进入对照组。

1.1.2动物模型构建 1%乙二醇配制：10 ml乙二醇加纯水定容至1000 ml；2%氯化氨配制：10 g氯化氨加纯水定容至500 ml。结石组大鼠每只每天给予1%乙二醇自由饮水，2%氯化氨灌胃2 ml/只。对照组给予正常水，余饲养条件相同，共饲养4周。喂养4周后，将大鼠放入代谢笼中收集24 h尿液后将大鼠处死，切取大鼠的一侧肾脏用10%福尔马林溶液固定，用于HE染色及免疫组化；切取大鼠的另一侧肾脏保存在-80℃冰箱，用于Real-time PCR。

1.2实验方法

1.2.1 24 h尿钙检查[11] 将收集到24 h大鼠尿流送生化自动分析仪检测尿钙浓度。

1.2.2检测肾结石大鼠模型构建是否成功 取结石组大鼠一侧肾脏做成石蜡切片后进行HE染色，在光镜下观察有无结石结晶形成来判断是否造模成功。

1.2.3免疫组化 取肾脏切片进行免疫组化，检测TRPV5在结石模型大鼠肾中的表达。

将两组大鼠一侧肾脏组织石蜡包埋后进行切片，TRPV5多克隆抗体（ABCAM公司）作为一抗（1∶20）， 山羊抗兔二抗（北京中衫金桥生物技术有限公司），PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色。用Image-Pro plus 6.0软件做半定量分析，每个标本选取5个不重叠视野分别测定光密度，并取平均值作为该例的OD值。

1.2.4实时荧光定量PCR 取两组大鼠另一侧肾脏的肾皮质，提取出总RNA，逆转录成cDNA，进行Real-time PCR，检测TRPV5在结石模型大鼠肾中的表达。

取大鼠肾脏组织约60 mg，按Trizol（美国Invitrogen公司）操作方法，抽取大鼠肾脏组织总RNA，检测提示抽提的RNA未见明显降解，可做为逆转录模板。TRPV5引物：上游引物5′-TCCGTGATGCCAACCGTACAC-3′，下游引物5′-GCCCCAATGACTGTCACGAGT-3′，GAPDH引物：上游引物5′-CGGCAAGT-TCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-CGCCAGTAGACTCCACGACAT -3′。取总RNA 2 μL，根据逆转录试剂盒（北京天根生化科技有限公司）操作方法逆转录合成模板cDNA，再进行实时荧光定量PCR，检测Ct值，计算TRPV5 Ct值与GAPDH Ct值的比值。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 24 h尿钙检查结果

结石组的24 h尿钙浓度为（0.63±0.09）mmol/24 h，对照组为（0.36±0.06）mmol/24 h，结石组大鼠24 h的尿钙浓度明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2肾结石大鼠模型肾组织HE染色结果

结石组在肾小管区域能看到大量结石结晶形成（图1），提示造模成功。

2.3两组大鼠的肾脏组织免疫组化结果

结石组大鼠与对照组大鼠肾脏组织TRPV5表达的OD值分别为（0.38±0.07）、（0.62±0.10），提示TRPV5在兩组大鼠肾脏组织均有表达，且结石组大鼠肾脏组织的TRPV5蛋白表达水平低于对照组（P<0.01），并设有阴性对照（图2-4）。

2.4 Real-time PCR结果

结石组大鼠肾脏组织的TRPV5 mRNA表达量低于对照组（P<0.01）（图5）。

3讨论

泌尿系结石由多种因素引起，我国泌尿系结石的发病率为1.2%～6.0%[1]，近年来，遗传及代谢方面成为研究结石的热点。钙是泌尿系结石的重要成份，含钙结石患者中约有1/3合并高钙尿症[2]。既往研究提示，尿钙浓度升高容易诱发形成含钙肾结石[2-3]。Daudon等[4]研究提示高钙尿是特发性泌尿系含钙结石形成的主要因素。泌尿系结石的治疗方法有开放手术取石，体外冲击波碎石，以及输尿管镜、肾镜等联合激光、气压弹道等技术，但术后复发率较高[5-6]，结石复发患者的尿钙浓度高于结石未复发患者的尿钙浓度[7]。Hess等[8]研究也提示，结石复发的患者中经常出现高钙尿。因此，高钙尿是形成泌尿系结石的重要因素。

TRPVl-TRPV6是TRPV的6个成员，其中TRPV5与TRPV6跟钙代谢及调控有关[9-10]。TRPV5是介导钙离子跨细胞膜转运的通道，可以调控尿钙水平，其表达下降可能引起高钙尿[11]，但具体机制目前仍不清楚。钙的主动吸收主要位于肾的远曲小管和集合管[12]，远曲小管的后半段（DCT2）和集合管（CNT）参与尿钙重吸收，且是钙离子调节激素作用部位，TRPV5在这两个区域均有表达。TRPV5表达缺失的小鼠，其肾脏的远曲小管和集合管对钙离子重吸收明显减少，用TRPV5基因敲除的小鼠研究发现其尿钙排泄量比正常组要高出6倍[13-14]，提示TRPV5缺乏可导致高尿钙，TRPV5对尿钙水平的调控起到关键作用。TRPV5激酶构成了一种新的信号通路，Yang等[15]通过WNK（D561A/+）基因敲除鼠制作PHAⅡ动物模型，检测远曲小管的calbindin-D28k（CBP-D28k）表达，提示TRPV5（D561A/+）基因敲除鼠显著表达CBP-D28k，他们认为TRPV5上调CBP-D28k的表达，是导致PHAII模型中高钙尿的原因。对遗传性高尿钙结石大鼠模型研究提示其TRPV5基因和蛋白表达水平低于正常对照组大鼠，但尿钙水平则比对照组高[16]。

由此可见，TRPV5是尿液中钙离子重吸收的重要通道，TRPV5的表达与泌尿系结石的发生率成负相关[17]，其缺乏或表达降低可产生高钙尿，而肾结石患者多数伴有高尿钙，推测TRPV5表达下降导致尿钙浓度升高，这可能是含钙结石的形成因素之一。本实验通过建立大鼠肾结石模型，研究结果显示结石组大鼠的24 h尿钙浓度明显高于正常对照组大鼠，而其肾脏组织的TRPV5蛋白表达水平、TRPV5 mRNA表达量则低于对照组。

结合本研究结果，提示TRPV5介导钙离子转运通道，其表达下降或缺乏可使肾小管对钙的重吸收减少，进而产生高钙尿，尿液中的钙因过饱和析出，形成含钙肾结石。除此之外，肾脏远曲小管后半段（DCT2）和集合管（CNT）与尿钙重吸收密切相关，又是多种钙离子调节激素的作用部位，TRPV5对尿钙重吸收的调控是否受激素影响，目前相关报道较少，需进一步研究。

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（收稿日期：2018-06-20 本文编辑：闫 佩）