木犀草素对黑素瘤细胞增殖、侵袭、凋亡及血管内皮生长因子表达的影响

付银锋 康文娣

1河南省中医院健康体检中心（郑州 450002）；2河南中医药大学第一附属医院皮肤科（郑州 450000）

皮肤恶性黑素瘤（cutaneous malignant melano⁃ma，CMM）是一种起源于黑色素细胞的恶性肿瘤，具有易转移、转移早、侵袭性强、病死率高等特点。目前，CMM的临床治疗手段有限，治疗极具难度［1-2］。因此，寻找一种安全性高、疗效好、副作用小的抗黑素瘤药物迫在眉睫［3］。木犀草素是一种天然的四羟基黄酮化合物，广泛存在于多种蔬菜和药用植物中，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抑制血管生成等多种药理活性［4-6］。目前研究表明，木犀草素在结肠癌［7］、乳腺癌［8］、胶质母细胞瘤［9］等多种肿瘤中发挥重要的抑癌作用，包括抑制癌细胞增殖、转移，并诱导癌细胞凋亡等。但木犀草素在CMM中的作用还不清楚。黑色素瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡及血管内皮生长因子（endothelial growth factor，VEGF）表达与CMM的发展进程密切相关。因此，本研究通过探讨木犀草素对黑素瘤细胞系A375和B16F10的增殖、侵袭、凋亡及VEGF表达的作用及其分子调控机制，从而确定木犀草素在CMM发展中的作用，为木犀草素治疗CMM提供理论依据。

1 材料与方法

1.1细胞培养及药物处理A375和B16F10细胞（美国ATCC），用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基在细胞培养箱中培养。当细胞生长至密度约为80%～90%时，将细胞分别接种于不同孔径的孔板中，待细胞生长至密度约为70%～80%时，进行不同剂量（20、40、60 μmol/L）的木犀草素处理。

1.2实验分组将A375和B16F10细胞分别分为4组：对照组、木犀草素20 μmol/L组、木犀草素40 μmol/L组、木犀草素60 μmol/L组。

1.3CCK⁃8检测将对数期细胞以5×103/孔接种于96孔板，每组设4个复孔。在木犀草素处理0、24、48、72 h时分别进行CCK⁃8检测。每孔加入100 μL含10%CCK⁃8试剂的无血清RPMI 1640培养基，培养箱内继续培养1 h，然后用酶标仪检测450 nm波长下的OD值。

1.4Transwell实验细胞贴壁后进行60 μmol/L的木犀草素处理，24 h后消化收集细胞，PBS洗涤3次，更换无血清培养基，调整细胞密度为5×105/mL。在预铺有matrigel胶的Millicell insert上室中加入200 μL细胞悬液，下室中加入含10%FBS的RPMI 1640培养基，共培养24 h后，取出上室，棉签擦去上室的残留细胞，90%酒精常温固定30 min，0.1%结晶紫常温染色10 min。倒置显微镜照相并计数。

1.5流式细胞仪检测将对数期细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板，每组设4个复孔。在60 μmol/L的木犀草素处理48 h时，每孔分别加入5 μL An⁃nexin V⁃FITC 和 5 μL PI试剂，轻轻摇匀后闭光孵育15 min，于1 h内进行流式细胞仪检测。

1.6Western blot将对数期细胞以2×104/孔接种于24孔板，当60 μmol/L的木犀草素处理48 h后进行Western Blot检测。用RIPA裂解液（含PMSF）裂解细胞，离心收集上清，然后用BCA试剂盒进行蛋白定量。通过SDS⁃PAGE凝胶电泳分离蛋白，然后通过半干转方法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。随后经5%脱脂奶粉封闭后，加入Bcl⁃2（1∶500）、Bax（1∶500）、Caspase⁃3（1∶500）、VEGF（1∶1000）、p⁃Akt（1∶1000）、Akt（1∶1000）、p⁃mTOR（1∶1000）和mTOR（1∶1000）等一抗4℃孵育过夜。然后加入相应二抗（1∶10000）室温孵育1 h，Odys⁃sey红外激光成像系统进行扫描。GAPDH表达量作为内参。

1.7RT⁃PCR将对数期细胞以2×104/孔接种于24孔板，当60 μmol/L的木犀草素处理48 h后进行RT⁃PCR检测。用Trizol试剂提取细胞RNA，用紫外分光光度计定量。根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA，然后以cDNA为模板检测VEGF的mRNA水平。反应程序如下：94℃，5 min；变性 94℃，30 s；退火57℃，30 s；延伸72℃，30 s；40个循环。以β⁃actin 作为内参，采用 2⁃△△Ct法比较分析mRNA水平。

1.8统计学方法采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析，计量资料数据均采用x±s表示，单因素方差分析各组间的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1木犀草素抑制黑素瘤细胞的增殖如图1A所示，与对照组 HEK293T 细胞相比，20、40、60 μmol/L木犀草素处理72 h对HEK293T细胞的增殖活力无显著影响，说明这3个浓度的木犀草素对正常细胞没有生长抑制作用，无细胞毒性。与对照组相比，20、40、60 μmol/L木犀草素处理能够显著抑制A375和B16F10细胞的增殖，而且抑制效果具有药物浓度和时间依赖性，木犀草素浓度越高，处理时间越长，增殖抑制效果越明显（图1B、1C），所以后续实验选择60 μmol/L木犀草素处理48 h为处理条件。

2.2木犀草素促进黑素瘤细胞的凋亡如图2A、2B所示，与对照组相比，60 μmol/L木犀草素处理48 h后，A375和B16F10细胞的凋亡率显著提高。如图2C、2D所示，与对照组相比，木犀草素60 μmol/L组Bcl⁃2的蛋白表达显著下调，而Bax和Caspase⁃3的表达显著上调。

2.3木犀草素抑制黑素瘤细胞的侵袭通过Transwell实验对细胞的侵袭能力进行检测发现，在A375和B16F10两种细胞系中，与对照组相比，木犀草素60 μmol/L组侵袭的细胞数目显著减少（图3）。

2.4木犀草素抑制黑素瘤细胞中VEGF的表达如图4所示，在A375和B16F10两种细胞系中，与对照组相比，木犀草素60 μmol/L组VEGF的mRNA和蛋白表达显著降低。

2.5木犀草素抑制PI3K⁃Akt⁃mTOR信号通路如图5所示，在A375和B16F10两种细胞系中，与对照组相比，木犀草素60 μmol/L组p⁃Akt和p⁃mTOR的蛋白表达水平下降，差异有统计学意义，而Akt和mTOR的蛋白表达差异无统计学意义。

3 讨论

木犀草素是一种具有多种药理活性的天然黄酮化合物，在多种癌症中都有显著的抗癌作用［10］。本研究首次探讨了木犀草素在黑素瘤细胞A375和B16F10中是否也发挥抗肿瘤作用，旨在为CMM的治疗提供新的方向和依据。

凋亡是细胞主动发生地程序化死亡，与肿瘤的发生密切相关，是肿瘤发生的重要机制。研究发现，木犀草素能够通过抗增殖和诱导凋亡来抑制恶性肿瘤细胞的生长［11］。因此笔者通过CCK⁃8检测细胞增殖，发现木犀草素可以显著抑制A375和B16F10细胞的增殖，且抑制效果呈浓度、时间依赖性。流式细胞仪检测结果表明，木犀草素能够诱导A375和B16F10细胞的凋亡。有文献表明，木犀草素能够通过内源性途径，包括增加Caspase⁃3水平，以及提高Bax/Bcl⁃2表达比例，来诱导胃癌细胞凋亡［12］。与该研究结果一致，本研究发现与对照组相比，木犀草素组的Bcl⁃2蛋白水平明显下调，而Bax和cleaved⁃Caspase⁃3的表达明显上调。以上研究结果说明，木犀草素能够通过抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡来发挥抗黑素瘤作用。

图3 木犀草素对A375和B16F10细胞侵袭的影响Fig.3 Effect of luteolin on the invasionof A375 and B16F10 cells

图4 木犀草素对A375和B16F10细胞中VEGF表达的影响Fig.4 Effect of luteolin on the VEGF expression in A375 and B16F10 cells

肿瘤细胞迁移和侵袭运动的能力与黑素瘤预后密切相关，迁移和侵袭运动的能力越强，肿瘤越易早期转移，预后越差。研究表明，木犀草素对肿瘤细胞的侵袭能力也有显著的抑制作用［4］，与该研究结果一致，本研究通过Transwell检测发现，与对照组相比，木犀草素处理显著降低A375和B16F10细胞的侵袭能力。文献报道，VEGF在CMM中过表达，促进细胞侵袭和转移，而抑制VEGF表达能够减少新生血管的生成，从而抑制细胞增殖和侵袭［13］。有文献报道，木犀草素发挥抗癌作用还与其抑制血管生成作用有关［6］。与以上研究结果一致，木犀草素能够显著降低A375和B16F10细胞中VEGF的表达。以上研究结果表明，木犀草素能够通过抑制细胞侵袭，降低VEGF的表达来发挥抗黑素瘤作用。

图5 木犀草素对A375和B16F10细胞中p⁃Akt、Akt、p⁃mTOR和mTOR表达的影响Fig.5 Effect of luteolin on the p⁃Akt，Akt，p⁃mTOR and mTORexpression in A375 and B16F10 cells

本文以上研究结果已经表明，木犀草素具有抑制黑色素瘤细胞增殖、侵袭、VEGF表达，且促进细胞凋亡的生物学作用，因此我们进一步初步探讨潜在的分子机制。PI3K/Akt/mTOR信号通路与肿瘤的发生密切相关，能够调节细胞周期、细胞迁移、蛋白合成、能量代谢等众多生命活动［14］，在黑素瘤的发生发展过程中具有重要的调控作用［15］。研究表明，木犀草素通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路在人绒毛膜癌细胞的治疗中发挥重要作用［16］。在本研究中，笔者发现木犀草素能够抑制A375和B16F10细胞中p⁃Akt和p⁃mTOR的蛋白水平，与前人研究结果一致，说明木犀草素对黑素瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的调控可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

综上所述，本研究证实了木犀草素具有抗黑素瘤的能力，能够抑制黑素瘤细胞A375和B16F10的增殖和侵袭能力，并诱导细胞凋亡，这可能与其降低VEGF表达，抑制PI3K⁃Akt⁃mTOR信号通路的作用有关。该发现为木犀草素在CMM治疗上的临床应用提供了理论依据。但是，本研究仅在体外细胞水平证实了木犀草素的抗黑素瘤作用，后期仍需在体内明确其作用，且还需更加详细地阐明其分子调控机制。