艾拉莫德对干燥综合征模型小鼠的影响

吴晓畅 王领 张娜 赵福涛

上海交通大学医学院附属第九人民医院风湿免疫科（上海 201999）

干燥综合征是一种主要侵犯外分泌腺的自身免疫性疾病，能导致口干、眼干及内脏系统损害等临床表现［1］。该病发病率高，严重影响患者生命质量。其病理特征为外分泌腺大量淋巴细胞浸润及实质组织细胞破坏；血清中多种炎性因子水平升高，并参与到疾病发展过程［2］。因此，抑制炎性细胞浸润外分泌，抑制炎性因子产生及作用通路是治疗该病的关键，但目前针对该病治疗上主要以对症治疗为主，目前有效治疗的药物有限。艾拉莫德作为一种具有新的抗炎和免疫调节性质小分子药物，已用于类风湿性关节炎的治疗，根据作用机制临床上也在试用于治疗其它多种风湿病，包括干燥综合征［3］，且收到了确切疗效，但缺乏基础研究的支持。本研究拟在通过小鼠体内实验探究艾拉莫德对于干燥综合征模型（NOD）小鼠的作用，从而探讨艾拉莫德的有效性及可能机制，为其治疗SS提供可靠的实验数据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物8周龄NOD雌性小鼠，18只，SPF级，平均体重为18～20 g；7周龄C57BL/6雌性小鼠，6只，SPF级；采购于中国上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物合格证号：2015000533754/2015000526399。生产许可证号码为：SCXK（沪）2012⁃0002。

1.1.2试剂（1）羧甲基纤维素钠为美国Sigma公司；艾拉莫德原药（商品名：艾得辛）先声药业提供，批号：A17⁃160903；3%戊巴比妥钠由实验中心配制；0.1M枸橼酸缓冲液、4%多聚甲醛、PBS缓冲液均购自中国上海实验试剂有限公司；（2）IL⁃17 ELISA试剂盒、IFN⁃γ ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；（3）伊红染液、苏木素染液均购自中国北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2方法

1.2.1实验分组选取8周龄雌性NOD小鼠18只，随机分成3组（6只/组）：模型组、艾拉莫德干预1组、艾拉莫德干预2组；雌性C57BL/6小鼠6只，作为正常对照组；均喂养于无特殊病菌的恒温条件下，饮水瓶给水。至第10周龄时（实验第0天），艾拉莫德1组每只予10 mg/kg艾拉莫德灌胃治疗；艾拉莫德2组予30 mg/kg艾拉莫德灌胃治疗；模型组和正常对照组每只小鼠等体积0.5%羧甲基纤维素灌胃，每天固定时间点灌胃1次。给药量按动物与人等效剂量换算表计算得出。

1.2.2进食量、饮水量、体重变化量测量每2天固定时间点测量一次小鼠进食量（投喂重量-剩余重量，单位：g/组）、饮水量（给水重量-剩余重量，单位：g/组）、体重（单位：g/组），直至鼠龄16周停止。

1.2.3血清IL⁃17、IFN⁃γ测定16周龄时处死小鼠，并眼球取血，常规分离血清，冻存于-80℃冰箱中，同批以ELISA测定血清中IL⁃17、IFN⁃γ水平，按照试剂盒说明书操作。450 nm读取吸光度值，绘制标准曲线，读取各组血清标本因子含量。

1.2.4颌下腺组织学观察将小鼠处死后，取小鼠颌下腺组织，置于10%多聚甲醛中固定，组织脱水、透明化、浸蜡和包埋，以4 μm厚度切片；将制作好的组织切片用苏木素一伊红（HE）染色，切片常规脱蜡，水化，染色，脱水、透明、封片。在光学显微镜下观察小鼠颌下腺组织病理形态学等的变化。根据Chisholm⁃Mason等提出的腺体活检分级标准进行评价：（2级以上为发病）。0级：未见淋巴细胞浸润；1级：少量淋巴细胞浸润；2级：淋巴细胞中度浸润；3级：偶有0～1个淋巴细胞浸润灶/5个低倍镜视野，伴有中度实质损伤；（淋巴细胞浸润灶：指4 mm2组织内至少有50个淋巴细胞聚集于腺体间质者为一个灶）；4级：易见2～3个淋巴细胞浸润灶/5个低倍镜视野，伴有重度实质损伤。

1.3统计学方法采用Graphpad prism 5和SPSS 20.0统计软件对所得数据按统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，多样本间比较采用单因素方差分析以及两组间Dunnett′s T3检验对比分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1艾拉莫德干预前后各组饮水量、进食量、体质量变化情况饮水量：如图1-A，饮水量在正常对照组基本保持不变，在模型组保持较高水平维持，而从实验第1天起，艾拉莫德1组和艾拉莫德2组给予干预后，饮水量都有明显减少，与模型组相比均有显著降低（P＜0.05）。进食量：如图1-B，进食量在正常对照组基本保持不变，且进食量正常；模型组随着鼠龄增大小鼠疾病进展，进食量逐渐降低；因艾拉莫德1组和艾拉莫德2组给予艾拉莫德干预，进食量出现轻度降低后又逐渐出现升高趋势，与模型组相比有显著升高（P＜0.05）。体质量：如图1-C，体质量在正常对照组随着鼠龄增大保持轻度增高趋势，但基本保持平稳，在模型组随着鼠龄增大小鼠疾病进展，体质量逐渐降低；因艾拉莫德1组和艾拉莫德2组给予干预后，体质量都有恢复并轻度增高，与模型组相比均有显著升高（P＜0.05）（图1）。

2.2血清IL⁃17、IFN⁃γ浓度变化情况艾拉莫德干预干燥综合征模型小鼠后，ELIAS测各组血清炎性因子IL⁃17、IFN⁃γ水平，其中，IL⁃17水平在艾拉莫德2组较模型组有减低，差异有显著性意义（P＜0.01）；艾拉莫德2组与艾拉莫德1组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；由可得出艾拉莫德剂量增加，炎性因子IL⁃17降低更明显。而IFN⁃γ水平在各组中的水平，差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。

图1 艾拉莫德干预对各组饮水量、进食量、体质量的影响Fig.1 Effect of Iguratimod on water intake（A）、food intake（B）and body weight（C）

2.3 颌下腺组织病理分级情况空白组16周龄C57BL/6小鼠均在Chisholm组织学评分标准的0级；模型组16周龄NOD小鼠均在组织学评分标准的3～4级；艾拉莫德1组NOD小鼠在组织学评分标准的2～4级；艾拉莫德2组NOD小鼠主要在组织学评分标准的1级。与正常对照组比较，模型组颌下腺组织淋巴细胞浸润明显，呈现灶性分布，外分泌腺结构破坏，腺管扩张，腺泡萎缩，而艾拉莫德1组（10 mg/kg）与艾拉莫德2组（30 mg/kg）小鼠颌下腺淋巴细胞浸润程度较模型组有明显减少，颌下腺组织结构破坏减轻。对颌下腺组织病理分级情况进行评价，艾拉莫德2组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）（图3～5）。

图2 艾拉莫德干预对NOD小鼠血清IL⁃17、IFN⁃γ浓度的影响（pg/mL± s）Fig.2 Effect of Iguratimod on serum IL⁃17、IFN⁃γ concentration in NOD mice

3 讨论

干燥综合征有着复杂的体液和细胞免疫异常，病理显示为外分泌腺的大量炎性细胞浸润，形成浸润灶，对腺体的结构及功能产生破坏。特别是T淋巴细胞，以及由T淋巴细胞产生的多种炎性因子，导致外分泌腺分泌功能的缺失，出现口干、眼干以及内脏器官受损表现，严重影响患者的生活质量［1］。近年来，对浸润性T细胞进行了广泛的研究，特别是以浸润性CD4+T细胞为主的细胞，T细胞及其特异性细胞因子在外分泌腺中显著增多，提示其在干燥综合征发病机制中起到重要作用［2］，其中IL⁃17、IFN⁃γ通过多种炎性通路影响干燥综合征疾病病理过程，为发病过程中重要的影响因子。其中，细胞因子IFN⁃γ是人类免疫系统调节的关键调节剂，在自身免疫反应中发挥着重要的作用［4］。在pSS患者眼结膜及唾液腺组织中发现 IFN⁃γ mRNA以及血清IFN⁃γ的高表达，并且其与T细胞浸润程度相关［5］。IFN⁃γ在干燥综合征模型和人类外分泌腺组织结构和分泌功能的破坏中起到至关重要的作用，可能与其诱导外分泌腺细胞凋亡、死亡和组织结构的改变有关［6］；IFN⁃γ调节趋化因子配体通路，从而促进炎性细胞在靶器官中聚集，启动异常免疫反应［7］。

图4～5 艾拉莫德干预对NOD小鼠颌下腺组织病理分级情况进行评价Fig.4～5 Effect of Iguratimod on salivary gland pathology grade in NOD mice

近年来大量研究发现，CD4+记忆效应T细胞亚群Th17家族，包括6个成员，特别是IL⁃17A能够起始强大炎症反应和诱导产生潜在的前炎性细胞因子，促进局部炎症反应［8］。在实验性干燥综合征小鼠研究中发现，IL⁃17A敲除的小鼠未表现出相应症状和组织病理学改变，而将Th17细胞过继转移至IL⁃17A敲除的小鼠体内，迅速诱导出SS样症状，且IL⁃17A能有效驱动B细胞的激活和成熟，最终导致抗体反应的增强［9］。IL⁃17A与淋巴细胞浸润程度和临床参数相关，随着淋巴细胞浸润程度的增加，IL⁃17A的密度增加。IL⁃17+单核细胞在导管周围浸润程度与腺体损害程度以及淋巴细胞浸润灶等级分数呈直接相关性，IL⁃17A mRNA越高，损伤越严重［10］。其可能的机制为IL⁃17A通过核因子-κB（nuclear factor⁃κB，NF⁃κB）信号通路，损害腺体组织细胞紧密链接屏障的完整性，导致外分泌腺功能缺失［11］。多项动物实验表明通过抑制IL⁃17、IFN⁃γ可有效改善淋巴细胞浸润等异常病理变化以及外分泌腺分泌情况［9］。

艾拉莫德是国家食品药品监督管理局临床批准的Ⅰ类新药，于2011年8月获得我国食品药品监督管理局批准，用于治疗成人活动性RA。其化学名为 N⁃［3⁃（甲酞胺基）⁃4⁃氧⁃6⁃苯氧基⁃4H⁃1⁃苯并毗喃⁃7⁃基］甲烷磺酰胺［12］。艾拉莫德不仅能选择性抑制环氧化酶-2（COX⁃2），还能抑制IFN⁃γ，IL⁃1、IL⁃6、TNF⁃a、IL⁃17 等细胞因子及免疫球蛋白（IgM、IgG）的产生，显著降低炎症反应［13］。目前国内外有大量艾拉莫德治疗类风湿性关节炎相关研究，其抑制的相关炎症通路与干燥综合征发病机制过程中炎性机制有相似性［14-15］，故理论上艾拉莫德可用于干燥综合征治疗，且目前艾拉莫德试用于治疗干燥综合征收到了确切疗效［3］。但具体治疗机制以及疗效情况有待进一步研究。本实验通过艾拉莫德对干燥综合征模型小鼠干预后相关指标改变的相关研究，从多发面探究艾拉莫德对干燥综合征是否有治疗效果以及可能的治疗靶点，为寻求安全有效的新型治疗药物提供依据。艾拉莫德为水难溶性药物，而羧甲基纤维素钠借助羧甲基纤维的增黏性及少量电荷而形成一种空间网络结构，起到了很好的助悬作用。将艾拉莫德加入到混悬介质5%羧甲基纤维素钠溶液中混合均匀制成混悬剂，保证了药物的均匀分布，可以增加其口服后在胃肠道分布面积，使吸收彻底，提高生物利用度。根据流变学及沉降体积比等参数，可知该制剂的稳定性良好。

非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠属于自发胰岛素依赖型糖尿病倾向的小鼠，它同时也是理想的自发性干燥综合征小鼠模型。它早期就会出现口干、饮水量增加的临床表现，以及血清中自身抗体滴度的升高，病理检测发现NOD小鼠外分泌腺体中存在淋巴细胞浸润，随着年龄增长，浸润度也逐渐变大［16］。呈现出与干燥综合征患者相似的免疫调节紊乱，病理学改变及临床表现，并有明显血清学抗体水平显著升高。颌下腺呈现组织破坏并伴有以Th17细胞为主的大量淋巴细胞浸润，且外周血有大量炎性因子分泌水平升高，包括IL⁃17及IFN⁃γ。其大量淋巴细胞浸润外分泌腺大约于12～16周龄时，且在雌性小鼠中发生率达60%～80%［17］。所以它被认为比较适合研究SS的动物模型。而C57BL/6为非易发病小鼠，必须经颌下腺匀浆或蛋白提纯物等实验性诱导后可建立干燥综合征模型小鼠［9］，故C57BL/6小鼠可作为正常对照组。

该实验中，予目前较成熟的干燥综合征动物模型鼠（NOD小鼠）为研究对象，并以非易感干燥综合征小鼠C57BL/6为正常对照组，予不同浓度艾拉莫德灌胃治疗，检测小鼠的饮水量、进食量、体重指标变化情况。并于6周后，对各组小鼠的颌下腺组织进行HE染色病理观察淋巴细胞浸润情况及病理分级评价，血清检测以IL⁃17、IFN⁃γ为代表的炎性因子的变化情况，了解艾拉莫德对干燥综合征炎性反应及外分泌腺功能影响。

实验结果显示，艾拉莫德能有效改善小鼠的外分泌功能，予艾拉莫德治疗小鼠的外分泌腺体中淋巴细胞浸润灶明显减轻，并减轻炎性因子的产生，特别是IL⁃17，因此具有保护腺泡组织结构的完整性及分泌功能。且艾拉莫德2组较低艾拉莫德1组效果更显著，这为临床应用艾拉莫德治疗干燥综合征提供必要的理论依据。该实验中，检测各组小鼠血清IFN⁃γ并未出现明显的改善，模型组与空白组也未出现明显差异，考虑IFN⁃γ在干燥综合征模型小鼠外周血中出现较IL⁃17晚，且培养小鼠周龄较小，炎症反应并未达到理想程度。可在后续实验中进一步增加实验周期，并监测不同周龄的炎性因子指标变化，外分泌腺淋巴细胞浸润情况，以及艾拉莫德干预影响。同时此次实验需进一步设置较高剂量组（50 mg/kg）甚至高剂量组（90 mg/kg），从而进一步探究其疗效是否具有剂量依赖性关系，同时可探究其高剂量毒性及半数致死量情况。

本实验初步证实了艾拉莫德可抑制干燥综合征模型小鼠（NOD小鼠）外分泌腺淋巴细胞浸润情况，减轻模型鼠血清中炎性因子生成，保护腺泡组织结构的完整性及分泌功能，明显改善小鼠的外分泌腺分泌功能及生存质量。说明艾拉莫德具有抗干燥综合征模型小鼠外分泌腺炎症作用，为临床应用艾拉莫德治疗干燥综合征提供了基础理论依据。