全反式维甲酸通过TGF⁃β1/SMAD4信号通路对宫腔粘连细胞模型纤维化的影响

刘丽敏 史文娟 何芳 胡海燕

深圳市妇幼保健院妇科（广东深圳 518000）

宫腔粘连（intrauterine adhesions，IUA），1948年由ASHERMAN［1］首次描述，因宫腔手术史带来的创伤、宫腔感染（结核）、放射线（子宫动脉栓塞术）等致使子宫内膜发生纤维化，造成子宫腔和或宫颈管腔出现部分或全部闭塞。月经量减少、闭经、不孕或反复性流产、慢性盆腔痛等是IUA常见的临床症状［2］，部分患者无明显症状。目前IUA的主要治疗方式是宫腔镜下宫腔粘连松解术及术后宫腔内放置物理屏障、辅助雌激素治疗［3-4］。IUA的发展与子宫内膜基底层损伤和子宫内膜修复障碍有关［1］，主要病理改变是炎症及细胞外基质纤维蛋白原的聚集，进而子宫内膜纤维化［5］。转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF⁃β）信号被认为是负责细胞外基质合成的最有效的促纤维化途径之一。而全反式维甲酸（all⁃trans retinoic acid，ATRA）是维生素A的生物活性衍生物，在体内和体外均表现出调节细胞分化、增殖和凋亡的作用［6-7］。最近的研究［8-10］表明，ATRA在一些纤维化疾病中发挥抗纤维化作用。SONG等［9］发现ATRA能阻断TGF⁃β信号通路，减弱博来霉素诱导大鼠肺部纤维化。目前国内外尚无有关ATRA与人宫腔粘连疾病的相关性研究。本实验通过TGF⁃β1作用原代人子宫内膜基质细胞（human endometrial stromal cells，HESCs）使其发生纤维化，进而构建IUA细胞模型，研究ATRA在IUA细胞水平中抗纤维化的作用机制。

1 资料和方法

1.1 资料

1.1.1标本选取2016年5月至2017年5月，在深圳市妇幼保健院妇科，因宫颈上皮内瘤变、子宫浆膜下肌瘤及肌壁间肌瘤行子宫切除术或因不孕症行宫腔镜下子宫内膜活检术妇女的新鲜子宫内膜8例，年龄30～45岁，经周期规律（25～ 32 d），术前未应用激素及宫内放置节育器3个月以上，且术后病理提示子宫内膜无病变。本研究获得深圳市妇幼保健院伦理审查会通过，术前征得患者同意及签署知情同意书。

1.1.2试剂试剂胎牛血清（NTC）；Recombinant Human TGF⁃β1（PeproTech）；Ⅰ型胶原酶、ATRA（Sigma）；兔抗人波形蛋白（Vimentin）抗体、兔抗人角蛋白CK⁃18抗体（SANTA CRUZ）；兔抗人α⁃SMA单克隆抗体、兔抗人COL1A1多克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体、山羊抗兔IgG H&L（CST）；兔抗人 SMAD4单克隆抗体（Abcam）；TRIzol re⁃agent、逆转录试剂盒、SYBR®荧光定量试剂盒（Ta⁃kara）；ECL（Millipore，美国）。

1.2 方法

1.2.1细胞培养原代人子宫内膜基质细胞的提取及培养。原代人子宫内膜基质细胞的提取采用0.2%浓度的Ⅰ型胶原酶消化-筛网过滤。眼科剪将刮宫式取出的子宫内膜组织尽量剪碎；加入0.2%Ⅰ型胶原酶4～5 mL，置入37℃恒温水浴锅内消化60 min；200～400目细胞筛网过滤，收集细胞悬液；1 000 r/min离心5 min，去上清，15%完全培养基重悬，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育；6～8 h后更换培养基（去除未贴壁细胞），得到纯化的子宫内膜基质细胞。2～3 d换液，1∶3～1∶4比例传代及冻存。

1.2.2细胞形态学观察及鉴定原代人子宫内膜基质细胞的形态学及鉴定。倒置显微镜下观察细胞形态学特征及其变化。细胞鉴定：免疫细胞化学法（immunocytochemistry，ICC）法检测 Vimentin和CK⁃18的表达。方法如下：细胞种植24孔板，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次；0.5%Triton⁃100室温孵育20 min，PBS洗涤3次；5%BSA室温封闭20 min，去除封闭液；分别加入Vimentin抗体和CK⁃18抗体，阴性对照组PBS代替一抗，4℃冰箱湿盒内孵育过夜；次日弃一抗，PBS洗涤3次；加入山羊抗兔二抗，37℃孵育20 min，PBS洗涤3次；辣根过氧化酶亲合素SABC，37℃孵育20 min，PBS洗涤4次；DAB显色液，避光37℃孵育5～10 min，去离子水终止染色；苏木素来复染细胞核，37℃孵育2 min，去离子水终止染色；常规梯度75%、85%、95%、100%乙醇脱水2 min，二甲苯透明1 min，倒置显微镜下观察、拍照。

1.2.3诱导培养TGF⁃β1诱导HESCs建立人宫腔粘连细胞模型及ATRA处理。0、2.5、5、10和20 ng/mL TGF⁃β1作用于HESCs 48 h，qRT⁃PCR法检测COL1A1、α⁃SMA mRNA表达。以10 ng/mL TGF⁃β1作用于HESCs 48 h，随后0、0.1、1和10 μm/mL ATRA作用 48 h，qRT⁃PCR、WB检测COL1A1、α⁃SMA、及SMAD4的mRNA和蛋白表达。

1.2.4蛋白表达qRT⁃PCR法检测各组细胞COL1A1、α⁃SMA、和SMAD4的mRNA的表达。TRIzol提取RNA，紫外分光光度仪测定RNA纯度及浓度，用Takara公司逆转录试剂盒逆转成cDNA。引物序列：COL1A1正向引物：5′⁃GAGGGCCAAGAC⁃GAAGACATC⁃3′，反向引物：5′⁃CAGATCACGTCAT⁃CGCACAAC⁃3′；α⁃SMA正向引物：5′⁃CGGGACATC⁃AAGGAGAAACT⁃3′，反向引物：5′⁃CCATCAGGCA⁃ACTCGTAACTC⁃3′；SMAD4正向引物：5′⁃CGGAT⁃TACCCAAGACAGAGC⁃3′，反向引物：5′⁃AAGGTT⁃GTGGGTCTGCAATC⁃3′；GAPDH 正向引物：5′⁃CG⁃GAGTCAACGGATTTGGTCGTAT⁃3′，反向引物5′⁃A⁃GCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC⁃3′。扩增条件：首先95℃预变性30 s；95℃变性5 s→60℃退火延伸30 s，共40个循环；溶解曲线95℃10 s→40℃60 s。

1.2.5Western blotWB法检测各组细胞COL1A1、α⁃SMA、和SMAD4的蛋白表达。裂解液裂解细胞提取总蛋白；通过BCA⁃100蛋白定量法得出蛋白浓度；配制8%分离胶、5%浓缩胶进行电泳；湿转法转膜；5%脱脂奶粉封闭1 h；分别加入COL1A1抗体、α⁃SMA抗体、SMAD4抗体、GAPDH抗体，4℃过夜，1×TBST洗膜5 min×3次；HRP标记的羊抗兔二抗室温下孵育1～2 h，1×TBST洗膜5 min×3次；条带中加入ECL显影液，超灵敏化学发光成像系统中显影。

1.3统计学方法采用SPSS 22.0软件分析数据，实验数据以均数±标准差表示，并行方差齐性检验，采用单因素方差分析（One⁃Way ANOVA）比较多组间蛋白及mRNA表达水平。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1HESCs的形态学特征细胞贴壁24 h后呈短梭形散在分布；72 h后，细胞伸展呈梭形或纺锤形，局部同心圆样或洋葱样形成细胞集落。3代后细胞形态稳定，生长旺盛，纤维样贴壁生长（图1）。

2.2HESCs的细胞鉴定ICC法检测间质细胞标记物Vimentin染色阳性，呈棕褐色；上皮细胞标志物CK⁃18阴性；PBS组阴性；CK⁃18与PBS组一致，进而证实为纯度较高的HESCs（图2）。

图1 HESCs细胞形态（100×）Fig.1 HESCsof different passages observed underan inverted fluorescence microscope（100 ×）

图2 免疫细胞化学染色，进行细胞鉴定（100×）Fig.2 Immunocytochemical staining was performed to identify HESCs under an inverted fluorescence microscope（100 ×）

2.3 COL1A1、α⁃SMA mRNA在各浓度TGF⁃β1组的表达qRT⁃PCR结果显示：0、2.5、5、10和20 ng/mL TGF⁃β1组COL1A1和α⁃SMA的mRNA表达均逐渐增加后下降，10 ng/mL TGF⁃β1组表达最高，差异均有统计学意义。后续选取10 ng/mL TGF⁃β1构建人宫腔粘连细胞模型（图3）。

图3 COLIA1、α⁃SMA在不同浓度TGF⁃β1组的表达Fig.3 Therelative mRNA expression of COLIA1、α⁃SMA in HESCs after the treatments of diverse concentrations of TGF⁃β1

2.4α⁃SMA、COL1A1和SMAD4在10 ng/mL TGF⁃β1及各浓度ATRA组处理后的表达qRT⁃PCR及WB结果显示，与NC组相比，1和10 μmol/mL ATRA组COL1A1、α⁃SMA和 SMAD4的mRNA和蛋白表达下降，其中1 μmol/mL ATRA组下降最明显。差异均有统计学意义（图4、5）。

图4 α⁃SMA、COLIA1及SMAD4 mRNA在10ng/mlTGF⁃β1、ATRA不同浓度作用组的表达Fig.4 Therelative mRNA expression of α⁃SMA，COLIA1 and SMAD4 in HESCs after the treatments of 10 ng/mL TGF⁃β1 and diverse concentrations of ATRA

图5 α⁃SMA、COLIA1及 SMAD4 蛋白在10 ng/mL TGF⁃β1、ATRA不同浓度作用组的表达Fig.5 The relative proteins expressions of α⁃SMA，COLIA1 and SMAD4 in HESCs after the treatments of 10 ng/mL TGF⁃β1 and diverse concentrations of ATRA

3 讨论

国内外学者普遍认为IUA的病因与子宫受损有关，可能导致月经异常，流产和不孕［3］。宫腔镜手术已成为诊断及治疗宫腔粘连的金标准技术［11］。但对于中重度IUA的手术效果和预后生殖，因子宫内膜生长不同步而不能满足患者要求［12］。术后宫内放置物理屏障：宫内节育器和Interceed防粘连膜。Interceed防粘连膜费用高，其5～7 d开始吸收，28 d左右完全吸收，且部分患者出现术后宫内感染症状，加重了粘连的发生。宫腔粘连是世界难题，其严重威胁着女性的生育功能及生殖健康，进而影响家庭稳定及社会的和谐发展。探索IUA的基因生物学机制，在IUA形成过程中应有针对性地对子宫内膜纤维化进行治疗是迫在眉睫的需求。

TGF⁃β1被公认为是纤维化的启动因子。其可以激活包括SMAD［13］、MAPK途径等多条信号传导通路促进纤维蛋白原的异常合成增多；TGF⁃β1能够促进多种细胞转化成肌成纤维细胞（MF），包括成纤维细胞、血管内皮细胞及肾小管上皮细胞等，并能诱导其表达α⁃SMA，而α⁃SMA是研究MF转分化的标记物［14］。TGF⁃β1是诱导上皮-间质转化（EMT）并导致细胞外基质（ECM）作为胶原蛋白过量沉积的器官纤维化的标志［15-16］。本研究中TGF⁃β1作用HESCs后，COL1A1、α⁃SMA mRNA水平高表达，证实TGF⁃β1能够诱使HESCs发生纤维化改变构建IUA细胞模型，进而为研究ATRA对IUA的纤维化的作用机制提供模型支持。

SMAD家族是TGF⁃β信号通路中重要的细胞内信号转导分子。SMAD4与磷酸化的smad2/smad3结合后形成复合体，转位至细胞核并与DNA元件结合，调控靶基因的表达［17］。在本研究中，通过TGF⁃β1诱导HESCs后促使SMAD4升高激活该信号通路，导致COL1A1、α⁃SMA高表达。全反式维甲酸（ATRA）是维生素A的生物活性衍生物，在体内和体外均表现出调节细胞分化，增殖和凋亡的作用［6-7］。相关研究报道，ATRA可明显抑制TGF⁃β/SMAD信号通路的激活［18］。本研究与其结论一致，在 IUA细胞模型中，ATRA抑制TGF⁃β/Smad信号通路，COL1A1、α⁃SMA的mRNA及蛋白水平明显下降，改善细胞纤维化。因此，ATRA有减轻IUA的子宫内膜再生修复中的纤维化的作用。ATRA相对成本低，改善Interceed防粘连膜费用高情况，便于临床宫腔粘连的预防和治疗的应用，有可能成为临床预防与治疗宫腔粘连的措施之一。