医学院校流式细胞仪实验平台技术开发和研究生实验教学应用实践的探讨

谢旦立，郑蒙蒙，郑斌娇，楼永良

（温州医科大学，温州 325035，1.检验医学院 生命科学学院；2.检验医学教育部重点实验室）

流式细胞仪是一种多参数条件下快速分析和精确分选细胞的现代化实验教学和科研仪器。随着流式细胞仪、荧光探针种类和荧光探针标记技术的不断发展和完善，流式细胞仪的应用领域和范围不断被拓展，现已广泛应用于临床检验、生物医学、环境科学和材料学等不同学科和技术领域[1-8]。因此，流式细胞技术平台已成为各大院校、高水平医院和科研院所科研技术平台的重要组成[9]。

目前，全球商业化的流式细胞仪主要分两类：一类以分析功能为主，应用于临床检测及常规科研，一般具有操作相对简单，易掌握的优点；另一类是具有高速分选功能的高端科研型，研发趋势是越来越多的荧光检测参数和越来越快的分选速度。相比分析型流式，这类产品一般来说操作较复杂，难掌握。作为医学院校，温州医科大学（以下简称我校）目前也已装备多台流式细胞仪，包括BD FACS AriaII（分析/分选型）、BECKMAN COULTER Moflo XDP（分析/分选型）、BECKMAN COULTER CytoFLEX（分析型）和BD Accuri C6（分析型）等，并在医学免疫学和临床免疫学检验等本科生课程、细胞生物学技术等硕士研究生课程中开设了流式细胞术的实验和理论课，旨在培养学生对流式细胞术理论、操作和应用能力的有效结合。流式细胞术是目前生物医学科研平台必不可缺的技术，开设研究生流式细胞课程和技术培训，将为研究生今后从事相关科研工作提供技术保障。因此，随着流式细胞技术的不断发展，如何建设好流式细胞技术服务平台，如何提供多样化和高水平的流式细胞应用及深度开发现有平台的技术服务项目等一系列问题，越来越受到高校和各类科研院所的关注。笔者结合流式细胞仪使用的心得，探讨流式细胞仪在实验教学和技术平台建设等方面的应用。

1 积极引入前沿流式细胞实验技术和解决方案

目前，国内多数医学院校流式本科实验教学主要在免疫学及其相关的实验课等课程中涉及，内容包括讲解流式细胞仪的原理、方法、步骤和应用等[10-13]。从1980年北京师范大学生物系引进国内第一台流式细胞仪（BD FACSIII）以来，国内的流式细胞仪装机总量和应用水平已经有长足的发展与进步，其中大部分装机的流式细胞仪以分析型为主。随着我们国家对基础科研的不断重视及高水平研究成果的不断涌现，流式细胞仪的综合应用已不局限于细胞周期和细胞凋亡或两色、三色和四色等。而流式细胞仪在这30年里也快速发展，包括激光器种类和数量、可检测的荧光类型和数量、品牌种类、各种专利技术等方面的不断进步。因此，为适应流式细胞技术日新月异的发展，帮助学生拓展科研思路，亟需在医学院校研究生培养中引入前沿的流式细胞实验技术，开发在新时期下与时俱进的流式细胞技术平台。

根据我校目前的科研需要，我们以科研平台BD FACS AriaII流式细胞仪为例，主要列举：①基于多色分析的Carboxyfluorescein succinimidyl ester（CFSE）标记法和Bromodeoxyuridine（BrdU）掺入法的细胞增殖功能检测；②基于多色分析的体内细胞蛋白质磷酸化水平检测；③基于多色分析的细胞因子多因子检测；④基于BD Index分选功能的快速细胞单克隆化及在研究生培养中的应用。

1.1 基于多色分析的CFSE标记法和BrdU掺入法的细胞增殖功能检测 细胞增殖功能检测是目前细胞生物学和免疫学实验研究中的常见技术和实验方法。常规的方法包括MTT法、CCK-8法和细胞周期法等，但存在灵敏度较低、操作复杂、实验结果不够直观和教学效果较差等问题。在科研工作中，我们采用CFSE标记法来跟踪被标记体外培养细胞的分裂增殖情况，并在临床检验诊断学、生物学和免疫学专业硕士研究生的流式细胞技术理论或实践中进行推广应用，以替换上述传统实验方法，拓宽相关专业研究生对体外检测细胞增殖功能技术的认识面。多参数分析条件下的CFSE标记法相比传统MTT等方法在检测体外培养细胞的分裂增殖功能中具有结果更直观、更全面的优点，如可同时检测混合培养细胞中特定细胞亚群双参数（细胞因子表达 vs.分裂增殖、细胞存活率 vs. 分裂增殖）下细胞增殖与其他细胞功能事件关系等（见图1-2）。此外，由于MTT和CCK-8法无法直接检测体内细胞的分裂增殖能力，我们将BrdU腹腔注射实验小鼠，利用BrdU掺入法追踪小鼠体内特定类型细胞的分裂增殖功能情况（见图3）。通过将CFSE标记和BrdU掺入法引入相关专业研究生的流式细胞技术理论和科研实验技能培训中，使流式细胞技术的实验课内容更贴近于科研，拓宽流式细胞技术服务的应用领域。

图1 流式细胞术检测活化后小鼠脾脏CD4+T细胞CFSE/IL-2双参数分析细胞增殖与IL-2表达

图2 流式细胞术检测活化后小鼠脾脏CD4+T细胞CFSE/细胞死活染料双参数分析细胞增殖与细胞存活率关系的示意图

图3 流式细胞术检测细菌感染小鼠对肝巨噬细胞分裂增殖能力影响

1.2 基于多色分析的体内细胞蛋白质磷酸化水平检测 传统的检测细胞蛋白质磷酸化水平的实验方法主要通过Western blot，耗时较长，过程复杂，需采用内参蛋白进行定量分析，且无法分析混合细胞样品中某一群细胞蛋白质的磷酸化水平。通过荧光标记的流式细胞磷酸化抗体，并采用胞内染色的方法，流式细胞技术可检测大多数胞内蛋白磷酸化水平，且染色过程通常可以在1 d内完成，且无需内参即可比较不同样本或同一混合细胞样本中不同群细胞某一蛋白磷酸化水平的差异，大幅缩短实验时间（见图4）。因此，开展该技术的教学，可提高相关专业研究生对蛋白质磷酸化检测的认识，使其在科研工作中能有的放矢地选择最优的方法来进行蛋白质磷酸化的检测，充分调动科研的主观能动性，培养创新意识和创新能力，提高科研实践能力。

图4 流式细胞术检测细菌感染小鼠对肝中性粒细胞AKT磷酸化的影响

1.3 基于多色分析的细胞因子多因子检测的应用细胞因子主要具有免疫调节等作用，与许多疾病的发生密切有关。细胞因子种类繁多，对于某一种细胞因子表达的检测，以往的方法主要通过ELISA法进行定量测定，耗时长，通量小，一次仅能检测一种细胞因子。随着BD公司和BioLegend公司等相继推出细胞因子多因子检测试剂盒后，一般可同时检测10种以上细胞因子的表达量，该法结合ELISA和流式细胞术的优点，待测因子选择灵活，研究人员可根据研究需要自由组合和定制检测指标，检测范围宽，灵敏度高，样品用量少，一般仅需25 μL以下，且可根据标准品制作标准曲线对样品进行定量分析。我们采用了BioLegend公司的LEGENDplex细胞炎症因子检测（13因子）试剂盒，其能通过制备标准曲线，同时定量分析TNF-α、IFN-γ和IL-1β等13种细胞因子的表达（见图5）。该试剂盒主要通过荧光微球技术的免疫“双夹心”液相检测方法，其中13种微球偶联有对应的13种细胞因子的生物素化的捕获抗体，同时带有不同强度APC荧光，并根据其大小分为A、B两群，通过捕获样品中相对应的细胞因子，再通过链亲和素-PE反应，检测APC和PE双信号来读取13种细胞因子的表达情况。该法的理论和实践教学可使研究生，尤其是科研课题涉及免疫相关技术的研究生在了解常规ELISA和流式细胞术检测基本原理的基础上，将两者知识点有机连贯起来，并灵活结合到具体的科研实验中，实现人员培训与前沿应用之间的有效融合。

图5 BioLegend多因子流式细胞术检测试剂盒（13因子）细胞因子标准品检测示意图

1.4 基于BD克隆分选功能的快速细胞克隆化 细胞的克隆化是目前许多生物医学课题中构建各类基因工程改造细胞株所必需的过程。传统的方法采用有限稀释法同时结合抗生素筛选，该法耗时长。我们采用BD FACS AriaII分选模块的克隆分选功能（也称索引分选），将转染后的单细胞分选至96孔细胞培养板中，经培养后可快速获得多个稳定转染的细胞克隆，大大缩短筛选时间（见图6）。

图6 BD FACS AriaII Index sorting模式示意图

因此，我们通过利用CRISPR-Cas9技术细胞基因敲除实验，对相关专业的研究生进行从质粒构建、转染、细胞培养和细胞克隆分选整个过程（见图7）的理论、实验技术培训。该实验内容设计，在体系上适合研究生较全面地理解和掌握细胞生物学和分子生物学基本技术的同时，将流式细胞术真正融入到具体的案例中，发挥该技术的优势，不仅能够更好地帮助研究生理解流式细胞克隆分选技术的重要性，更是培养和锻炼他们科学思考能力，学会如何科学有效地选用合适高效的方法设计完成科研课题。此外，对于仪器应用而言，此类涉及较多知识点的大型实验，实验中技术和知识覆盖面广，涵盖了从分子生物学、细胞生物学和免疫学等方法，并包括有细胞培养、分子克隆和转染、流式细胞无菌样本制备等步骤和技能。此类实验能锻炼研究生对利用流式细胞技术全程综合设计科研方案能力，培养研究生的科研创新意识和探索科研的兴趣。

2 流式细胞技术平台建设与研究生实践教学的思考

图7 利用BD FACS AriaII Index sorting功能和CRISPR-Cas9基因编辑技术快速获得突变细胞株克隆的示意图

流式细胞术已进入科研和临床工作的各个方面，医学院校研究生对流式细胞技术在医学领域应用了解较少，限制了流式细胞技术在研究生科研和临床工作中的应用。因此，医学院校研究生中系统开展流式细胞技术理论和实践训练刻不容缓：一方面，作为平台建设而言，流式细胞技术平台服务的对象主要是科研人员，以科研需求推动流式细胞技术平台建设及人员培训，可较大程度搭建适合本单位的流式细胞技术平台；另一方面，包含流式细胞多色分析和高端分选两块内容的综合性实验教学项目，是提供高水平生物医学研究服务的重要手段。以高水平技术建设高质量平台，以高质量教学和科研技术平台促进研究生教学质量不断提高等一系列形式，提高流式细胞技术平台的水平、培养研究生对流式细胞技术的动手操作能力，为流式细胞技术平台建设和研究生职业发展奠定基础。

此外，考虑到目前流式细胞仪型号和品牌较多，高端机型为各厂家重点推荐的仪器。不论高端还是低端型号，机器不会思考问题，最为重要的还是操作人员。在选择合适流式细胞仪时需充分调研，综合各型号的突出优点和不足之处，尤其是是否能紧密围绕本单位科研工作需求，是否能对本单位现有技术平台起重要提升作用为主要考量标准之一。紧密跟踪和开展流式细胞技术的前沿应用，尤其是对已有仪器功能和应用的不断开发，才能提升平台技术人员对现有仪器性能的熟悉和了解，并可大幅度提高大型仪器利用率，最大程度发挥现有仪器的资源优势、技术应用范围和师资特长，还可提高研究生的科研专业训练水平，有助于其今后真正将流式细胞技术运用于自己的科研和临床工作中。