YC-1对肝部分切除术后老年小鼠认知功能及海马神经元凋亡的影响

葛叶盈，王秀珍，袁娜，袁力勇，陈洁

（宁波市第六医院 麻醉科，浙江 宁波 315040）

术后认知功能障碍（post-operative cognitive dysfunction，POCD）是严重的术后中枢神经系统并发症。POCD的发病机制至今尚不清楚，脑血管栓塞、痉挛、脑组织的异常灌注等导致的低氧被认为是POCD的主要原因[1]。低氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）作为一种转录因子，在缺氧条件下，可以启动多种下游基因的转录激活，包括能激活下游促凋亡基因p53和BNIP3的表达，加强神经细胞的凋亡，导致神经细胞变性坏死，从而引起认知功能障碍[2]，但迄今为止未见HIF-1α参与POCD损伤机制的报道。目前认为老龄是唯一被明确的POCD危险因素[3]，手术创伤可能是主要的原因，本课题组前期研究发现肝切除术后老龄小鼠可出现短期认知功能障碍[4]，但具体机制尚不清楚。本研究观察肝部分切除术对老年小鼠认知功能和海马HIF-1α及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响，同时观察使用特异性HIF-1α抑制剂3-（5′羟甲基-2′呋喃基）-1苯甲基引唑（YC-1）对上述各指标的影响，以探讨HIF-1α蛋白及其下游基因作为POCD治疗新靶点的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物及分组：选用C57BL/6雄性小鼠，清洁级，鼠龄18个月，体质量25～35 g，由宁波大学动物研究所提供，实验动物许可证号：SYXK（浙）2013-0191，置25 ℃环境中饲养。利用Morris水迷宫测试剔除实验第5天在2 min内仍找不到平台的小鼠，最后筛选出48只并按随机数字表法分成3组：假手术组（Sham组，n=16）、手术+0.9%氯化钠溶液组（手术+NS组，n=16）和HIF-1α抑制剂YC-1组（手术+YC-1组，n=16），各组小鼠根据手术后测试时间的不同分为术后1 d、3 d两个亚组，各亚组8只。

1.1.2 主要试剂和仪器：鼠抗人HIF-1α单克隆抗体购自美国Novus公司，凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3多克隆抗体购自美国CST公司，YC-1购自英国Cayman公司，辣根过氧化氢酶标记羊抗鼠或羊抗兔的二抗购自美国Pierce Chemical公司，Morris水迷宫系统购自上海吉量科技公司。

1.2 方法

1.2.1 模型的制备：将小鼠以10%（体积百分比）水合氯醛按0.04 mL/10 g腹腔注射麻醉，当翻正反射消失后将其仰卧位固定并消毒，于剑突下腹部正中线切开1.5～2.0 cm切口，分离左侧叶肝脏，在远端蒂部以1号丝线结扎后切除肝左叶，彻底止血后逐层关腹。Sham组腹腔注射水合氯醛麻醉，在肝部分切除术相同手术部位做切开缝合术。YC-1组在肝部分切除术前30 min、手术结束时以及术后1～3 d每天给小鼠腹腔注射1 mg/kg的YC-1（溶于0.9%氯化钠溶液），具体参照文献[5]；手术+NS组参照手术+YC-1组的相同时间注射相同剂量的0.9%氯化钠溶液，给药后1 h，开始进行Morris水迷宫测试。

1.2.2 Morris水迷宫实验：参照文献[6]的方法，进行Morris水迷宫实验评价认知功能。Morris水迷宫由一直径120 cm，高50 cm的白色圆形水池和一个可移动位置的平台以及一套摄像、记录系统组成。计算机可以自动跟踪并记录下小鼠的游泳轨迹。当设定的训练时间已到或者小鼠已经爬上平台，计算机停止跟踪。软件自动算出小鼠在水池中找到平台所需要的时间（即逃避潜伏期）和跨越平台的次数。以定位航行训练和空间搜索测试小鼠的学习记忆能力。定位巡航实验：术前训练历时4 d，每日训练1轮，每轮每只小鼠训练4次，如小鼠在120 s内未到达平台，可引导小鼠上平台，并让小鼠在同一个入水点台上停留10 s，每次训练之间适当休息。实验的第5天，剔除2 min内不能到达平台的小鼠，休息1 d后手术。在手术后1 d、3 d，每天2次从离平台最远的象限，在固定的同一个入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠在90 s内找到并爬上平台的平均时间即逃避潜伏期，若在规定的时间内未找到平台，按90 s计算。空间探索实验：用于测量动物对于平台空间位置的准确记忆，即记忆的保持能力。定位巡航实验结束后撤除平台，任选一点将动物放入水中，观察90 s内小鼠在目标象限（原平台所在象限）中跨越平台的次数。

1.2.3 Western blot检测：小鼠行为学测试完毕后次日麻醉后断头取脑，冰上分离海马组织，取液氮冻存。采用Western blot法检测Bcl-2、Bax、活化型Caspase-3表达。实验开始后，将冻存的海马组织取出，加入蛋白裂解液，匀浆后低温高速离心，取上清液使用BCA法进行蛋白测定，-80 ℃低温冰箱保存。取40 µg总蛋白上样，SDS-PAGE电泳，电泳分离的蛋白转至硝酸纤维素膜，加入一抗，用含5%脱脂奶粉的1×TBST稀释兔抗鼠Bcl-2抗体（稀释度1:1 000）、Bax抗体（稀释度1:1 000）、活化型Caspase-3抗体（稀释度1:800），4 ℃孵育过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体（稀释度1:3 000），室温孵育30 min，再次洗膜后置于BCIP/NBT显色液显色，扫描蛋白印记图，Alpha软件系统（美国Alpha Gel Imaging公司）进行分析，β-Actin为内参，以目的蛋白条带灰度值与内参β-Actin条带灰度值的比值反映目的蛋白表达水平。左侧海马检测HIF-1α的表达水平，右侧海马检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，组内比较采用重复测量数据的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris水迷宫测试 与Sham组相比，手术+NS组术后1 d、3 d平均逃避潜伏期明显延长，空间探索跨越平台次数减少（P＜0.01）；与手术+NS组比，手术+YC-1组逃避潜伏期缩短，空间探索跨越平台次数增加（P＜0.05）。与术前比较，手术+NS组术后1 d、3 d平均逃避潜伏期明显延长，空间探索跨越平台次数减少（P＜0.01），而Sham组和手术+YC-1组差异无统计学意义（P＞0.05）。Sham组组内各时间点比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1和图1。

表1 各组小鼠Morris水迷宫找到平台的潜伏期和跨越平台数比较（每组8只，±s）

表1 各组小鼠Morris水迷宫找到平台的潜伏期和跨越平台数比较（每组8只，±s）

与Sham组比：aP＜0.01；与手术+NS组比：bP＜0.05；与术前比：cP＜0.01

跨越平台次数手术前 术后1 d 术后3 d 手术前 术后1 d 术后3 d Sham组 26.58±5.28 28.39±4.59 30.22± 5.73 6.79±1.73 6.96±1.27 7.07±1.42手术+NS组 26.70±4.63 41.48±8.27ac 56.70±15.94ac 6.86±1.18 4.24±1.08ac 3.49±1.05ac手术+YC-1组 27.08±4.29 35.21±8.72b 37.93±10.47b 6.49±1.46 5.26±1.25b 5.28±1.28b逃避潜伏期（s）组别

图1 术后1 d各组小鼠找到平台的游泳轨迹图

2.2 海马HIF-1α及Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达量的比较 术后1 d和3 d，与Sham组相比，手术+NS组海马HIF-1α、Bax、Caspase-3蛋白表达量增加，Bcl-2蛋白表达量减少（P＜0.01）；与手术+NS组比，手术+YC-1组海马HIF-1α、Bax、Caspase-3蛋白表达量减少，Bcl-2蛋白表达量增加（P＜0.05）。Sham组和手术+YC-1组比较，4种蛋白表达量的差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图2-5。

3 讨论

图2 3组小鼠海马HIF-1α蛋白相对表达量的比较

图3 3组小鼠海马Bcl-2蛋白相对表达量的比较

图4 3组小鼠海马Bax蛋白相对表达量的比较

POCD正成为外科领域关注的问题，国内外大量研究认为POCD是在老年患者中枢神经系统退化的基础上，由手术和麻醉诱发，多种因素联合作用所致的神经功能减退，涉及到中枢神经系统、内分泌和免疫系统的紊乱[7-8]，所以本研究采用老年小鼠作为实验对象。近年来POCD与低氧的关系渐渐引起学者的广泛关注，国内外研究报道POCD的发生与脑氧饱和度（regional cerebral oxygen saturation，rSO2）下降有关，认为rSO2监测有可能是POCD的有效预测工具之一[9-10]。

图5 3组小鼠海马Caspase-3蛋白相对表达量的比较

HIF-1是一种特异性地结合于低氧反应元件的蛋白，由α和β这2个亚单位组成。HIF-1β能够稳定性地表达，不受氧含量的调节，但HIF-1α是低氧诱导产生的转录激活因子，在细胞凋亡造成神经系统损害发生中起关键作用[11-12]。本课题组前期研究表明，肝部分切除术后1 d和3 d小鼠的认知功能受到抑制[4]。本研究选择肝部分切除术作为POCD模型，术后1 d、3 d作为观察点，由于海马与认知功能有关[13]，因此选择海马作为研究对象。细胞凋亡过程中，Caspase家族和Bcl-2家族起关键作用，Bcl-2是凋亡抑制因子，Bax是凋亡促进因子，而Caspase-3是凋亡的最终执行者[14-15]。大量研究表明，认知功能障碍与神经细胞凋亡的关系密切[16-17]。本研究结果显示，与Sham组比较，手术+NS组术后海马HIF-1α及凋亡因子Bax、Caspase-3表达增加，而凋亡抑制因子Bcl-2减少，与行为学显示的手术+NS组平均逃避潜伏期明显延长，空间探索跨越平台次数减少一致，提示HIF-1α参与了POCD的小鼠海马神经元凋亡过程。

YC-1是HIF-1α的特异性抑制剂，在转录后水平抑制HIF-1α的表达[18-19]。本研究通过应用YC-1抑制HIF-1α表达后检测肝部分切除术后HIF-1α及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达水平，进一步探讨HIF-1α在肝部分切除术后的神经细胞凋亡中的作用。结果显示抑制HIF-1α蛋白表达的手术+YC-1组细胞凋亡均显著低于未经YC-1处理的手术组，由此进一步证明HIF-1α高表达在肝部分切除术后的细胞凋亡过程中发挥着损伤作用，其机制涉及抑制Caspase-3凋亡信号通路介导的细胞凋亡过程。同时行为学测试也表明应用YC-1抑制HIF-1α表达后与手术+NS组比较，平均逃避潜伏期明显缩短，空间探索跨越平台次数增多，再一次提示HIF-1α通过诱导神经元凋亡通路参与了POCD的发病机制。

综上所述，老年小鼠肝部分切除术后可出现短期的认知功能障碍，HIF-1α致小鼠脑组织神经细胞凋亡可能是其发病机制之一，YC-1可以通过抑制海马神经元的凋亡来改善肝部分切除术后小鼠的认知功能。