黄芪多糖对棕榈酸损伤的人脐静脉内皮细胞内一氧化氮水平的影响

胡兰兰，陈佳君，陈君第霞，潘晓琼，胡臻

（温州医科大学附属第二医院 中医科，浙江 温州 325027）

血管内皮功能障碍是血管内皮损伤的早期表现与始动因素，在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发生与发展中起着促进作用[1]，防治血管内皮功能障碍成为了目前防治AS的研究热点。黄芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是中药黄芪中的活性成分之一，研究表明APS可以促进一氧化氮（nitric oxide，NO）的生成，改善血管内皮功能障碍[2-3]，然而其相关机制尚未完全清楚。NO的生成主要受一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和NADPH氧化酶（NADPH oxidase，Nox）的活性影响。研究证实磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）以及Akt为eNOS的上游激酶，可以激活eNOS，产生NO[4]，目前许多研究发现APS可以活化AMPK以及Akt蛋白[5-7]，而当上调Nox活性，可以增加NO的灭活[8]。本研究以棕榈酸诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）建立内皮细胞损伤模型，探讨APS对内皮细胞内NO生成的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 APS购于美国ATCC公司，HUVECs株购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，胎牛血清、DMEM高糖培养基及棕榈酸购于美国Sigma公司，NO试剂盒购于南京建成科技有限公司，Trizol、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购于美国Inritrogen公司，RNA提取试剂盒购于美国Ambion公司，Nox4、eNOS、β-actin引物合成于美国Invitrogen公司，人Nox4、AMPK、P-AMPK抗体购于美国Proteintech公司，人eNOS、p-eNOS抗体购于上海ABclonal公司，p-Akt、GAPDH抗体购于德国CST公司，所有二抗均购于美国Santa Cruz公司，ECL曝光液试剂盒购于上海碧云天生物公司。

1.2 细胞生存率检测 选取对数生长期的细胞，通过计数板技术，按每孔5×103个细胞将HUVECs种植到96孔板中，每组设置个6个副孔，实验组分别加入400 mg/L（A组）、800 mg/L（B组）、1 600 mg/L（C组）APS溶液，对照组加入等体积PBS溶液，培养24 h。每孔加入10 μL MTT溶液，继续放置在37 ℃恒温箱培养4 h后，吸干每孔溶液，加入100 μL的二甲基亚砜（DMSO）溶液，于酶标仪下检测460 nm波长的吸光度。细胞生存率（%）=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.3 建立内皮细胞损伤模型及实验分组 HUVECs用DMEM高糖培养基加10%胎牛血清及100 U/mL青霉素G在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。取4～8代HUVECs用于实验。待细胞生长到70%～80%融合时，加入250 mmol/L的棕榈酸共同孵育，建立HUVECs损伤模型，并将细胞随机分为对照组、模型组、APS 400（加入400 mg/L APS）组、APS 800（加入800 mg/L APS）组、APS 1600（加入1 600 mg/L APS）组，按不同浓度要求依次加入等体积的APS溶液共同孵育24 h。

1.4 MTT试验检测APS的细胞毒性 选取对数生长期的细胞，通过计数板技术，按每孔5 000个细胞将HUVECs种植到96孔板中，每组设置个6个副孔，实验组分别加入不同浓度APS溶液，对照组加入等体积的PBS溶液，培养24 h。每孔按要求加入10 μL MTT溶液，继续放置在37 ℃恒温箱培养4 h后，吸干每孔的溶液，加入100 μL的DMSO溶液，于酶标仪下检测460 nm波长的吸光度。

1.5 Western blot检测 收集各组细胞，弃去上清液，PBS溶液清洗3遍，加入细胞裂解液后，12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，酶标仪595 nm处测定蛋白浓度，取样加入上样缓冲液，沸水中煮10 min，取70 μg上样量进行SDS-PAGE实验，电转至PVDF膜，待电转结束后，用含有5%脱脂奶粉的TBS溶液常温摇床封闭1.5 h，1×TBST溶液清洗3次/5 min后，加入相应一抗溶液，冰箱摇床孵育过夜，1×TBST溶液清洗3次/7 min，加入相应二抗溶液，孵育1 h，1×TBST溶液清洗3次/5 min，biorad凝胶成像系统下ECL孵育显影，检测指标为：AMPK、p-AMPK、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Nox4、GAPDH。

1.6 Q-PCR检测eNOS、NOX4 mRNA的表达 取各组细胞，提取RNA：①弃去上清，加入1 mL Trizol充分裂解细胞；②加入200 μL氯仿，静置3 min，12 000 r/min、4 ℃下离心10 min；③溶液静置10 min后，加入500 μL异丙醇，颠倒混匀，12 000 r/min、4 ℃下离心15 min；④弃去上清，加入1 mL无水乙醇，洗涤沉淀，7 500 r/min、4 ℃下离心5 min。合成cDNA：①酶标仪260、280 nm双波长下测定RNA浓度与纯度，灭菌水配平；②按反转录试剂盒说明书进行操作，依次加入Oligo（dT）试剂、dNTP试剂、提取的RNA、DTT试剂及M-MLV酶反转录得到cDNA。PCR定量及分析：方法参照荧光定量试剂盒说明书，加入合成DNA、SYBR染料、引物以及灭菌水，设置好PCR仪的温度与循环，进行PCR定量，最后采用Mastercyler ep realplex检测系统进行定量分析。检测指标为：eNOS、NOX-4及β-actin。

1.7 硝酸酶还原法检验细胞内NO含量 NO化学性质非常活泼，在人体内很快转化为NO2-，再转化为NO3-，本实验利用硝酸酶的还原特异性将NO3-还原成NO2-，通过显色深浅来间接测定NO浓度的高低。收集以上各组细胞悬液，按NO试剂盒说明书进行具体操作，采用酶标仪测定各组550 nm，0.5 cm光径处的吸光度值。按照以下公式计算NO含量：NO含量（μmol/L）=（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准吸光度-空白吸光度）×标准品浓度（100 μmol/L）×样品测试前稀释前倍数。

1.8 统计学处理方法 采用Graphpad7.0和SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间比较用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同溶度APS对HUVECs相对生存率的影响 各浓度APS（400 mg/L、800 mg/L）细胞生存率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且相对生存率均大于100%；黄芪多糖在一定浓度范围内（＜1 600 mg/L）能促进HUVECs增殖并无明显细胞毒性。见表1。

表1 不同浓度的APS溶液对HUVECs相对生存率的影响（每组n=6，±s）

表1 不同浓度的APS溶液对HUVECs相对生存率的影响（每组n=6，±s）

与对照组比：aP＜0.05

组别 细胞相对生存率（%）对照组 95.07±1.31 A组 102.80±2.40a B组 106.20±4.21a C组 102.40±5.49

2.2 APS对HUVECs内AMPK、p-AMPK、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Nox4蛋白表达的影响 棕榈酸可以抑制HUVECs内p-AMPK、p-Akt、p-eNOS蛋白表达，上调Nox4蛋白的生成，差异有统计学意义（P＜0.05）；

NO是维持血管内皮正常生理功能的重要因子，其生物活性下降会导致内皮依赖性血管舒张功能损害，促进AS的形成[9]，目前被认为是机体对抗AS的第一道防线。NO主要由细胞内eNOS合成，p-eNOS的Ser1177位点可以激活eNOS，产生NO。而最新的研究表明AMPK作为细胞内能量感受器，是eNOS的上游激酶，能够促进eNOS Ser1177位点的磷酸化，活化eNOS，促进NO的生成[10]。另外，Akt蛋白也被认为是调节eNOS活性功能的酶，p-Akt的Ser/Thr位点可以激活eNOS，促进NO的产生[11]。而NO的灭活主要与Nox的活性有关，Nox4是Nox表达在内皮细胞上的一种主要亚型，是血管内皮细胞O2-的主要来源，Nox4表达上调或活性增加可以使O2-产生增多，O2-而加入APS干预后，HUVECs内p-AMPK、p-Akt、p-eNOS蛋白表达较模型组上调，且APS 1600组与比，差异有统计学意义（P＜0.05）；eNOS蛋白表达量升高，Nox4蛋白表达量降低，且APS 800组和APS 1600组与模型组比差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1-2。

图1 不同浓度的APS溶液对棕榈酸损伤的HUVECs内p-AMPK、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Nox4蛋白表达的影响

2.3 APS对HUVECs的eNOS、Nox4 mRNA表达的影响

用棕榈酸刺激HUVECs后，与对照组相比模型组细胞内eNOS mRNA表达下降、Nox4 mRNA的表达上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。而用APS干预后，与模型组相比3个APS组细胞内eNOS mRNA的表达上升、Nox4 mRNA的表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.4 APS对HUVECs内NO含量的影响 用棕榈酸刺激HU-VECs后，模型组HUVECs内的NO含量较对照组下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；而与模型组比，用不同浓度的APS干预作用后，HUVECs内的NO含量随着APS的浓度增加而增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

图2 不同浓度的APS溶液对棕榈酸损伤的HUVECs内p-AMPK、p-Akt、p-eNOS、eNOS、Nox4蛋白相对光 密度的影响

表2 APS对棕榈酸损伤的HUVECs内eNOS、Nox4 mRNA表达的影响（每组n=6，±s，%）

表2 APS对棕榈酸损伤的HUVECs内eNOS、Nox4 mRNA表达的影响（每组n=6，±s，%）

与对照组比：aP＜0.05；与模型组比：bP＜0.05

组别 eNOS mRNA Nox4 mRNA对照组 100 100模型组 46.74± 5.71a 273.0±17.28a APS 400组 93.08±10.43b 207.2±20.33b APS 800组 126.50±12.74b 153.1±21.38b APS 1600组 214.90±26.87b 136.8±19.44b

表3 APS对棕榈酸诱导的HUVECs上清液中NO含量的影响（每组n=6，±s）

表3 APS对棕榈酸诱导的HUVECs上清液中NO含量的影响（每组n=6，±s）

与对照组比：aP＜0.05；与模型组比：bP＜0.05

组别 NO（μmol/L）对照组 77.97±4.97模型组 38.02±6.69a APS 400组 55.67±1.25b APS 800组 62.41±1.90b APS 1600组 70.98±4.09b

可迅速与NO结合生成氧化能力更强的ONOO-，导致NO灭活增多，引起其生物活性下降，因此，Nox4的活性在内皮细胞氧化损伤中也起决定性作用。

APS是从中药黄芪中提取的一种有效活性成分，目前研究发现APS可以提高异丙肾上腺素诱导的肥厚大鼠内皮细胞内NO的含量，起到保护内皮功能障碍的作用[12]，APS可以促进人心脏微血管内皮细胞内NO的生成，改善内皮细胞的缺氧状态和缺氧损伤，保护内皮细胞[13]。然而APS影响NO生成的调控机制目前并未完全阐明。而目前许多研究证实APS可以活化AMPK以及Akt蛋白，因此APS是否可以促进AMPK、Akt蛋白的活化、激活eNOS，产生NO以及APS是否可以通过调节Nox活性，减少NO灭活来达到其防治内皮功能障碍的作用，是本研究的主要内容。

本研究以棕榈酸诱导HUVECs来建立血管内皮损伤细胞模型。棕榈酸作为一种饱和游离脂肪酸，可以通过诱导细胞凋亡与炎症因子释放，造成内皮损伤，并且促进AS的发展[14-16]。因此，实验采用棕榈酸诱导内皮细胞损伤，从细胞层面上观察APS对AMPK、Akt、eNOS及Nox4蛋白活性表达以及细胞内NO含量的影响，探索其改善血管内皮功能障碍、保护内皮细胞损伤的可能机制。

实验结果表明用棕榈酸刺激HUVECs后，细胞内p-AMPK、p-Akt、p-eNOS蛋白以及eNOS mRNA表达下降，Nox4蛋白及Nox4 mRNA的表达上升，细胞内NO的含量降低，这些可以证明血管内皮细胞损伤模型诱导成功。而用APS干预后，能够促进细胞内Akt以及AMPK蛋白的磷酸化，缓解棕榈酸对细胞内eNOS活性的抑制，激活eNOS，促进NO的生成，并且下调Nox4的表达，减少NO的灭活，提高其生物活性。

综上，APS可以上调榈酸诱导HUVECs内p-AMPK、p-Akt、p-eNOS蛋白以及eNOS mRNA的表达，下调Nox4蛋白及Nox4 mRNA的表达，增加细胞内NO的生成，达到缓解内皮细胞损伤的作用，其相关的调控机制可能与其能活化细胞内AMPK及Akt蛋白，激活eNOS，降低Nox4的表达有关。