猪瘟E2蛋白的抗免疫抑制能力及遗传特性

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(浙江省缙云县动物疫病预防控制中心，浙江 缙云 321400)

猪瘟病毒结构蛋白中的E2蛋白是囊膜糖蛋白，也是猪瘟病毒的主要保护性抗原，研究表明E2蛋白是猪瘟病毒的一个重要免疫蛋白，能够刺激机体产生中和抗体从而提供保护性免疫，用E2蛋白免疫猪只，能有效抵御猪瘟强毒的攻击。因此它已成为当今猪瘟免疫和检测研究的热点，以E2蛋白抗体为检测对象的阻断ELISA在猪瘟抗体的监测实验中得到了充分的运用。但是目前的猪瘟防疫尚以弱毒疫苗为主，其免疫血清都为多克隆抗体，而实验中多采用猪瘟正向间接血凝试验，正是利用多克隆抗体能与抗原结合产生凝集、沉淀的原理来检测抗体效价。同时猪瘟免疫最易受到蓝耳病毒PRRSV的免疫抑制干扰，产生免疫耐受，从而影响了除E2外其它多种抗体的产生，用正向间接血凝试验检测显示：PRRSV感染猪的猪瘟免疫，不但不能提升免疫抗体水平，甚至可下降至2 log直至1.5 log；但用猪瘟E2蛋白阻断ELISA试验显示：其受检血清的抗体阻断率则不受猪PRRSV免疫抑制干扰的影响，且与猪瘟间接血球凝集试验的合格与否和效价高低无关，与猪瘟IHA试验阳性结果高度相关。即当PRRSV感染猪的猪瘟免疫的IHA效价下降为零合格率时，E2阻断ELISA的合格率仍可高达90%，虽然两种试验结果反差之大，可IHA试验的阳性结果则与E2蛋白阻断ELISA的阳性结果有90%以上的符合率，即当IHA试验为合格时同样高度符合E2阻断ELISA的试验结果，从而可推断出E2蛋白的抗免疫抑制能力。了解这些现象的本质，对做好猪瘟免疫及检测工作，可能会有较重要的实践指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30日龄PRRSV隐性感染猪，来自缙云县某猪场，长势一般，无可见临床症状。

1.2 疫苗与试剂 猪瘟疫苗由中牧股份生产，批号：1712017-2；高致病性猪蓝耳灭活苗由杭州/佑本生产，批号：170605；猪瘟间接血凝抗体检测试剂盒由中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号：20171019202；IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒来自于北京爱德士元亨生物科技有限公司REF99-43220 31-OCT-2018；LSI猪繁殖和呼吸综合征抗体检测试剂盒来自于北京天之泰生物科技有限公司 批号MAY-2018。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计 设试验1组和试验2组(均为PRRSV感染组)和对照组(PRRSV防疫组)，每组10头。各组仔猪于30日龄时各肌注猪瘟疫苗2 mL/头；对照组则同时分点肌注猪蓝耳灭活苗2 mL/头，注：猪瘟与蓝耳分点注射。首免后2周，以上法同样剂量加强免疫1次，分别于30 d、37 d、44 d、57 d、72 d、89 d、100 d、130 d、180 d时静脉采血分离血清，用间接血凝法和阻断ELISA法检测猪瘟抗体效价，以间接ELISA法检测猪蓝耳抗体，再以间接血凝试验阳性阻断ELISA阴性者，用猪瘟疫苗再行加强免疫，3周后采血检验，如阴性结果则再免疫再检验。

1.3.2 试验血清的检验

1.3.2.1 猪瘟正向间接血凝试验 操作方法依据国家《猪瘟诊断技术》(GB/T16551-208)标准进行。试验成立条件：对照孔无自凝现象，阳性对照血清抗体效价≥1∶256、阴性对照 ≤1∶8。为排除非特异性凝集，待检血清使用前经56℃水浴灭活30 min。结果判定：以呈现“++”血凝反应的最高稀释度为该血清的间接血凝抗体效价。

1.3.2.2 猪瘟阻断ELISA试验 操作按试剂盒说明书。实验有效性：阴性对照平均OD(450)>0.5，阳性对照平均阻断率%≥50。计算公式：

阻断率%=100[NCXA(450)-样品A(450)]/NCXA(450)

结果判定：

阴性可疑阳性阻断率%≤3030<阻断率%<40阻断率%≥40

1.3.2.3 猪繁殖和呼吸综合征抗体间接ELISA检测试验 操作按试剂盒说明书，实验成立条件：阳性对照的平均值OD450>0.6，而且阳性对照平均值/阴性对照平均值>4.0 IRPC计算公式：

IRPC=[(OD450样品-OD450阴性对照平均值)/(OD450阳性对照平均值-OD450阴性对照平均值)]×100

IRPCPRRS抗体说明

小于或者等于20阴性大于20.0阳性

2 结 果

2.1 猪瘟正向间接血凝试验结果 试验组猪瘟的免疫，因受PRRSV的免疫抑制干扰的影响，在180日的观察期内，猪瘟平均抗体效价下降至3 log 及3至1.5 log。而对照组(即PRRSV被控制组)的猪瘟免疫，其猪瘟平均抗体效价即能从4 log上升至9.5 log，并能长期维持在8.4 log左右。见表1。

表1 PRRSV对猪瘟疫苗的免疫抑制危害

表中效价为各试验组中的10个样本平均数。

PRRSV对猪瘟疫苗的免疫抑制结果如图1。

注：猪瘟间接血凝试验的血凝效价是取以2为底的对数。图1 PRRSV对猪瘟疫苗的免疫抑制曲线

2.2 猪瘟阻断ELISA试验结果

试验期间试验组的平均合格率为93%，且在180日龄时仍能维持在100%。而对照组(即PRRSV被控制组)试验期间平均合格率也仅有90%。两者无明显区别(见表2)。

猪瘟正向间接血凝试验和阻断ELISA试验反应，当PRRSV感染猪(试验组)受到免疫抑制下调抗体水平表现零免疫合格率时，猪瘟E2蛋白却仍有高达90%以上的免疫合格率，而且两试验组间无明显差异，从而可证：它有坚强的抗免疫抑制能力。

2.3 间接血凝试验与阻断ELISA的结果符合率 试验证实间接血凝试验阳性结果与阻断ELISA结果高度相关，其符合率在90%以上，但它们的效价大小却与阻断率无关(见表3、表4 )。

虽然当PRRSV感染猪(试验组)受到免疫抑制下调抗体水平表现零免疫合格率时，猪瘟E2蛋白抗体阳性率却为90%，差异极显著。但对照组的两试验结果符合率却高达90%。

表2 猪瘟E2蛋白抗体阻断ELISA试验

表3 猪瘟间接血凝试验与阻断ELISA试验结果符合率

表4 猪瘟间接血凝效价高低与E2蛋白抗体阻断率的相关性

注：表4序号1～10为试验组；11～20为对照组100日龄仔猪试验数据。实验结果显示：猪瘟的间接血凝效价高低与E2蛋白抗体阻断率的大小与否无关。

2.4 各试验组的蓝耳抗体检测结果 猪蓝耳抗体检测显示：试验组猪群PRRSV感染严重，见表5。

表5 PRRSV感染猪与抗感染猪的

以上不难发现试验组与对照组的蓝耳抗体阳性率则没有明显区别，如仅以抗体阳性率来评估猪蓝耳疫苗的免疫质量，是容易出现较大误差的。

2.5 猪瘟E2蛋白的遗传特性 经二次猪瘟疫苗免疫后，ELISA结果不合格者，再多次重免后抽测结果其阻断率仍不合格，记录见表6。

表6 猪瘟E2蛋白免疫耐受试验

3 结果与讨论

3.1 试验显示 猪瘟免疫抗体效价，是免疫血清(多克隆抗体)在正向间接血凝试验中的直接反应，机体因受PRRSV免疫抑制的干扰，其猪瘟免疫抗体效价会下调至2 log以下。控制PRRSV的感染，能上调间接血凝效价的合格率为100%。认识其作用机制对进一步做好猪瘟和PRRSV的防疫和净化工作有着重要的指导意义。

3.2 试验表明 当试验组(PRRSV感染组)猪瘟间接血凝试验的群体合格率下降为零时，猪瘟E2蛋白抗体群体合格率(阻断率)却依然在90%以上，且与对照组(PRRSV控制组)ELISA试验的合格率基本一致。由此提示：PRRSV对猪瘟E2蛋白的免疫干扰影响甚微，亦则证明了猪瘟E2蛋白有可靠的抗免疫抑制能力。因此，它可以解释猪蓝耳病毒能对猪瘟免疫产生抑制干扰，影响了多克隆抗体的血凝效价，但阻碍不了E2蛋白抗体的产生。

3.3 试验提示 猪瘟间接血凝效价的高低与E2蛋白抗体阻断率的大小无关，但它的阳性结果则与E2蛋白ELISA试验的合格率高度相关。由于猪瘟E2蛋白抗体具有坚强的抗病毒能力，因此在有PRRSV感染的环境条件下，仅以间接试验的零合格率来评估猪瘟免疫质量肯定是欠科学的，当IHA试验出现阴性结果时，再用猪瘟E2蛋白ELISA试验复核是必要的。虽然猪瘟间接血凝试验的阳性结果与E2蛋白的阻断ELISA的结果有90%以上的符合率，但仍可从试验中发现有些个体多次免疫耐受的特质，是否有与遗传因素有关，有待进一步探讨。