猪丹毒的病原学诊断及药敏试验

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(1.浙江省动物疫病预防控制中心，浙江 杭州 310018；2.宁波市奉化区畜牧兽医总站)

宁波市奉化区某猪场生猪存栏720头，其中母猪68头。该场猪群于2018年5月开始发病，病初病猪食欲不振，病重的甚至食欲废绝，精神沉郁, 被毛粗乱，体温达到41.5 ℃以上，病猪粪便干硬呈颗粒状，部分病猪的背部、颈部、臀部、耳根等处出现扁平微凸起的紫红色疹块,多为方形、菱形或不规则的圆形，指压红色可出现暂时消退；病猪呼吸急促呈腹式呼吸；也有少量病猪出现关节肿胀伴有跛行等临床症状。对病死猪剖检，主要病变表现为: 肺充血、水肿，胸腔有淡黄色积液，淋巴结肿大，呈紫红色出血性炎症，十二指肠及空肠前段发生出血性炎症，脾脏充血肿大，呈淡红色；肾脏淤血肿大，呈弥漫性暗红色，纵切面皮质部有小红点，心内外膜小点状出血，关节肿胀，关节腔有多量浆液性纤维素性渗出液，渗出液为红色粘稠性胶冻样。发病由育肥猪开始，逐渐扩散至母猪、公猪和保育猪。病情前后持续了20多天，各类日龄猪只总共死亡150多头。2018年6月，该猪场将2头病猪肺脏送至浙江省动物疫病预防控制中心作进一步病原学诊断及药敏试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 设备 培养箱购自Binder公司，型号：KB115；显微镜购自ZEISS公司，型号：Scope. A1；生物安全柜购自Thermo scientific公司，型号：1300 Series A2，细菌鉴定仪购自生物梅里埃，型号：VITEK 2 COMPACT，灭菌器购自TOMY公司，型号：SX-700。

1.1.2 培养基和试剂 血琼脂平板购自郑州安图生物工程股份有限公司，革兰氏染色液试剂盒购自青岛高科技工业园海博生物科技有限公司，三糖铁琼脂及产硫化氢微量反应管购自青岛高科技工业园海博生物科技有限公司，革兰氏阳性菌鉴定卡购自生物梅里埃，药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.1.3 样本来源 2018年6月11日，浙江省宁波市奉化区某猪场送检的2头病猪肺脏，分别编号为肺1、肺2。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 无菌操作法切开病变组织，用接种环刮取病料接种于血平板，于37℃下培养24 h。

1.2.2 细菌鉴定

1.2.2.1 菌落形态 于血平板上培养18-24 h，观察菌落形态。

1.2.2.2 细菌形态及染色特性 挑取可疑菌落作革兰氏染色，油镜下观察细菌形态及染色情况。

1.2.2.3 过氧化氢酶试验 在洁净的载玻片上滴1滴3%的H2O2溶液，用接种环挑取适量的可疑菌在H2O2溶液中混匀，观察是否有气泡产生。

1.2.2.4 H2S观察 挑取可疑菌落穿刺接种于三糖铁斜面培养基，置37℃培养箱培养18-24 h，观察结果。

1.2.2.5 生化鉴定 用无菌棉签刮取适量细菌纯培养物混悬于3 mL无菌生理盐水中，使用VITEK 2浊度计测试细菌浓度，将细菌浓度调整至0.5～0.63麦氏单位，将GP细菌鉴定卡吸液导管置于菌悬液中，并置于细菌鉴定仪进行生化鉴定[3]。

1.2.3 药敏试验 按照NCCL推荐的K-B纸片琼脂扩散法[4]，选用临床上常用药物分别对分离纯化的菌株进行药敏试验。用无菌生理盐水将待检菌株制成0.5麦氏单位菌悬液，含菌量在5×107～5×108，用灭菌棉签拭子浸入细菌悬液中，在管壁挤去多余菌液，然后均匀涂布在90 mm血平板上，室温静止3-5 min后，无菌操作将药敏纸片均匀贴在上述血平板上，37℃培养48 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，判断待检菌株对各种药物的敏感性。

2 结 果

2.1 细菌形态学检查结果

2.1.1 菌落形态 肺1、肺2接种在血平板上培养24 h后，均出现细小、圆而凸起，有光泽，周围有轻微的溶血菌落(图1)。

图1 肺1接种平板菌落生长情况

2.1.2 细菌形态 在肺1血平板培养物中，挑取可疑菌落(编号为ZJYK-01235菌株)涂片作革兰氏染色，镜检为革兰氏阳性杆菌，菌体细长，菌体长短不一，平直或稍弯曲，有的呈长丝形，单独存在，有的呈短链或V形排列[2](图2)。

2.2 触酶试验结果 ZJYK-01235菌株触酶试验结果为阴性。

2.3 H2S产生情况 ZJYK-01235菌株在三糖铁斜面培养基中均有黑色沉淀，表明有硫化氢产生(图3)。

图2 ZJYK-01235菌株镜检(1000×)情况

图3 ZJYK-01235菌株H2S产生情况

2.4 生化鉴定结果 生化鉴定结果显示ZJYK-01235菌株为红斑丹毒丝菌，生化反应结果见表1。

表1 ZJYK-01235菌株两株细菌生化鉴定结果

注：+ 表示为阳性，- 表示为阴性

2.5 药敏试验结果 ZJYK-01235菌株药敏试验结果表明，该菌株对阿莫西林、恩诺沙星等敏感，对庆大霉素、卡那霉素等耐药(表2)。

表2 ZJYK-01235菌株药敏试验结果

注：S-敏感；I-中介；R-耐药

3 讨 论

丹毒丝菌属包括红斑丹毒丝菌(E.rhusiopathiae)、产单核细胞丹毒丝菌(E.monocytogenes)、扁桃体丹毒丝菌(E.tonsillarum)。猪源红斑丹毒丝菌最早于1882年首次分离鉴定，是一种世界性广泛分布的病原菌。红斑丹毒丝菌引起的猪丹毒是一种急性、热性、人畜共患传染病，其特征主要表现为急性败血症和亚急性疹块型，也有表现慢性多发性关节炎或心内膜炎[1]。丹毒丝菌可感染包括哺乳动物、禽和鱼类等70多种动物，其中猪最为敏感。猪红斑丹毒丝菌主要感染3-12月龄猪，一年四季均可发病，发病率一般为10%～15%，严重时死亡率可达50%。猪丹毒广泛流行于世界各地，为我国主要的猪传染病之一，对养猪业造成严重的经济损失[2]。

病猪和带菌猪是本病的传染源。带菌猪以及其他带菌动物的分泌物、排泄物排出菌体污染饮水、饲料、土壤、笼舍等，经消化道传染给易感猪。本病也可以通过损伤皮肤及蚊、蝇、虱等吸血昆虫传播。本病多发于夏秋季节，5-8月呈流行高峰期，尤其是气候闷热、暴雨之后较易流行，冬春寒冷季节发病则较少[5]。为防止天气突变所带来的应激反应，增强免疫，可在饮水中添加多维、黄芪多糖等抗应激、提高免疫力药物[6]。对猪舍、用具应保持清洁，可采用 1%～2%的氢氧化钠溶液对地面进行消毒，对猪舍也可用10%的石灰乳涂刷墙面等[7]，以减少环境中有害微生物的生长。

该场发病初期用强力霉素、氟本尼考拌料防治，由于病猪食欲不振甚至食欲废绝, 病猪并未摄入药物，每天都有猪只死亡，防治效果不佳；后改用青霉素或阿莫西林肌注，用阿莫西林拌料, 并将猪群中的病猪迅速隔离治疗，同时每天加强对猪舍消毒，病情得到有效控制。病情控制后又用猪丹毒、猪瘟二联弱毒疫苗对全场猪只进行免疫，20 d后回访，猪群病情稳定，无新病例发生。