免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定呕吐毒素的应用与分析

王金炫 王小平

江苏省句容市粮食局中心化验室 江苏句容 212400

呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，它主要有两类：一类是赤霉致呕毒素，能引起呕吐；另一类是赤霉烯酮具有雌激素的作用。这些毒素主要存在于麦粒的糊粉层和皮部，故以麦麸和面筋中较多，胚乳淀粉中较小。《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》GB 2761—2017规定食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）限量指标为1000 μg/kg。国家粮食局每年进行的夏秋两季粮食收获质量、卫生调查，就是保障我国粮食质量卫生安全。

句容市粮食局中心化验室担负着江苏省粮食局下达的国家粮食局夏秋两季收获质量、卫生调查和品质测报任务，从收获入库到生产加工等环节进行严格把关，把小麦中呕吐毒素控制在食品安全国家标准限量以内。2018年夏粮共检测小麦样品300余份，实验中掌握了GB 5009.111—2016免疫亲和层析净化高效液相色谱法呕吐毒素测定的操作要领，应用分析如下。

1 测定原理与仪器和试剂

1.1 测定原理

小麦检测样品中的呕吐毒素经水提取、免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱紫外检测器测定。样品溶液中各组分经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式展现出来；再用数据处理系统进行处理，按保留时间定性，外标法定量而得知被测组分含量。

1.2 测定仪器和试剂

安捷伦126液相色谱仪配有VWD荧光检测器；感量0.01 g、0.0001 g天平；试管研磨机、离心机、超声洗涤仪等；250 μL、1000 μL 移液枪；玻璃纤维滤纸、0.45 μm水相微孔滤膜、25 mL注射器、50 mL刻度离心管、脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱。

甲醇-水溶液（30+70）：量取15 mL甲醇加入到35 mL水中混匀，使用前脱气30 min；10%异丙酮：量取1 mL异丙酮定容至10 mL；标准品梯度的设置：待测物响应值应在标准曲线线性范围内，相当样品浓度 μg/kg 0、300、600、1200、1800、2400（分别吸取浓度为 1.007 μg/mL 标准使用液 0、0.075、0.150、0.300、0.450、0.600 mL，甲醇-水配至 1.5 mL）。

2 样品制备

2.1 检测样品

检测样品为本市收获质量卫生调查和夏粮入库样品共300余份，检测时间5月21日开始至6月30日，检测小麦类型均为混合小麦。

2.2 样品预处理

2.2.1 去杂。杂质是指小麦以外的其它物质，包括筛下物、无机杂质和有机杂质。首先分取大样1200 g，分四次筛选，每次数量约300 g，捡出筛上大型杂质并弃除下层筛筛下物，合并上下层筛上的粮食籽粒测定容重；然后再进行分样，部分样品留作水分和不完善粒测定，部分样品按质量标准规定捡出所有杂质后为净小麦，留作粉碎。

2.2.2 粉碎。取不少于500 g样品，用试管研磨机将其粉碎（细度通过20目）混合均匀后缩分至100 g，储存于样品瓶中，密封保存，供呕吐毒素提取用。

2.3 检测方法

水分测定按GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》方法进行；容重测定按GB/T 5498—2013《粮食检验 容重》方法进行；不完善粒测定按GB/T 5494—2008《粮食检验 粮食、油料的杂质、不完善粒检验》方法进行；呕吐毒素测定按GB 5009.111—2016《食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》中第二法《免疫亲和层析净化高效液相色谱法》进行。

3 测定步骤与结果

3.1 试样提取

按脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱使用说明书操作，具体步骤如下：

称取小麦粉碎样品25 g（准确到0.1 g）于250 mL具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇，加水125 mL混匀，置振荡器振荡20 min。提取液倒入试管中离心10 min（6000 r/min），上清液用玻璃纤维滤纸过滤，收集滤液于50 mL刻度离心管中。

样品滤液净化。将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温，拔出堵头流尽免疫亲和柱内原有液体，准确移取样液2.5 mL于亲和柱中，连接注射器样液以每秒1滴流速通过亲和柱；样液流尽后吸取20 mL水于注射器中以每秒2滴的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，抽干小柱。

样品净化液洗脱。注入1.5 mL甲醇于亲和柱中以每秒1滴流速进行洗脱，然后将洗脱好的样液倒入注射器针筒，连接0.45 μm水相微孔滤膜和液相上机小瓶，洗脱液通过滤膜进入小瓶，再以1∶1洗脱液和水进行稀释混匀待测。

3.2 安捷伦126液相色谱仪参考条件

色谱柱：Eclipse XDB—C18，4.6×25 mm，5 μm；流动相：甲醇:水（30∶70）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：50 μL；检测波长：218 nm；样品采集时间：10 min。

表1 部分小麦样品呕吐毒素检测结果

3.3 开机

3.3.1 软件操作（双击软件用首次创建的方法）

首先管冲洗：开启仪器状态准备就绪后，四元泵右击方法，扭松排液阀，改流量5.000，A管应用（约2 min气泡排完）；B管输100应用，气泡排空后改0，C管D管依次冲洗。

然后柱冲洗：改流量 1.000，改 B 管 30（30∶70 甲醇水为流动相）应用，关排液阀，冲洗20 min。

样品盘设置（P1盘和P2盘可随意放置）：如采用P1盘可以P1a1空白；P1a2至P1a7校正标准；P1a8样品依次排列。

3.3.2 样品检测

在线信号选择VWD，去掉FLD，基线走平后点运行；样品自动检测。

3.3.3 数据处理

数据选择：方法右击关联全部，信号FPD（关掉ECD）；打开数据今天的所有标样和样品，选用GC/CC定量，调用前处理，方法另存输文件名保存。

看色谱图：看被测物出峰时间删去多余杂峰，应用空白扣除，所有进样，使用指定空白确定；点击色谱图中的留用峰，峰作为化合物添加到方法；输入有关信息，点重新处理全部。

查看数据处理：峰详细信息、色谱图、校正曲线、样品信息、进样结果。

3.4 检测结果

3.5 关机

清洗管路：点击仪器状态把A管纯水瓶中管路放入甲醇瓶中，四元泵右击方法，旋排空阀去掉B管，改流速改为5 mL，冲洗5 min；冲柱子：流量改为1，关排空阀冲洗20 min；打开另一软件，关闭连接、确定、否，关闭图谱、关检测器、关主机。

4 检测质量控制

应用GB 5009.111测定呕吐毒素含量，为确保检测结果的准确性和可靠程度，对检测工作过程的各个环节进行有效控制，确认仪器的性能及整个检测工作质量是否满足实验要求。

4.1 加标回收试验

免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定呕吐毒素法样品前处理比较复杂，操作稍有不当就会使样品含量损失或污染，加标回收是最好的验证方法。通过回收率找出实验中各环节存在的问题，以确定其检测方法的适用程度。加标要从样品提取开始，进行空白加标、试样加标、洗脱过滤后样液三种类型加标。实验结果：空白加标回收106.6%、试样加标回收102.1%、洗脱后样液加标回收99.97%；符合GB/T 27404—2008附录F回收率80.0%～110.0%规定；证明免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定呕吐毒素检测方法适用。

4.2 人员比对

进行人员比对同一样品，相同仪器，不同人员进行操作，衡量人员操作技术水平是否符合规范要求。

从表2中可以看出，应用GB 5009.111法测定呕吐毒素操作正确、技术过关、数据准确，符合GB 5009.111重复条件下两次独立测定结果绝对差值不得超过算术平均值的23%规定要求。

表2 不同人员之间测定验证数据表

5 应用与分析

应用GB 5009.11法测定无机呕吐毒素含量，一是流动相必须脱气处理，以提高检测灵敏度；二是选择合适标准曲线梯度，取得标准品良好线性；三是选择适合流动相，以获得较好峰形；四是进行质量控制，保证检测工作质量。

5.1 脱气处理流动相提高检测灵敏度

流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体，以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。

5.2 选择合适标准曲线梯度取得良好线性

实践中不断摸索，选用合适的标准梯度，保证样液中待测物的响应值应在标准曲线线性范围内，使校正曲线相关系数达0.999以上，确保样品检测结果的科学性、准确性。

5.3 选择适合流动相以获得较好峰形

改善峰形，是提高灵敏度和定量分析精确度的目的。实际分析过程中，需要根据实验室条件和具体情况进行调整流动相的配比，样品出峰时间和峰形与流动相极性有很大关系，峰的保留时间6至15 min为宜；色谱峰区域宽度，是反应色谱分离条件好坏的重要参数，使其达到峰高的0.607处的要求。

5.4 进行质量控制保证方法准确应用

加标回收试验和开展技术核查是确保检测工作质量的具体措施，是衡量检测人员的业务技术水平，验证选用的检测方法是否得当，了解仪器性能的掌握情况，使之能够更好地应用方法，掌握操作技能，确保检测工作质量目标的实施。

综上所述，免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定呕吐毒素，要做到实验环境满足仪器运行条件，操作人员掌握技术要领，采取必要的质量控制技术以核查验证符合要求，才能确保准确应用。