男性不育患者精浆miR-551b水平变化及其临床价值*

朱媛媛，顾万建，徐 天，邵 永，王 成，张春妮

(1.江苏省中医院a.科技处；b.检验科，南京 210029；2.南京总医院a.生殖医学中心；b.检验科，南京 210002)

不育症影响了世界范围内大约15%的育龄夫妇，其中男性因素导致不育约占一半[1]。现有男性不育的诊断方法主要有精液常规检查、内分泌和基因分析、睾丸活检或穿刺，但对于准确区分不育男性价值仍然有限[2]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类在人和哺乳动物中进化高度保守的小分子非编码RNA，可通过与靶基因信使RNA3’端非翻译序列完全或不完全碱基配对，在转录后水平调节靶基因蛋白表达。研究显示，miRNA广泛参与睾丸发育、精子发生等生理过程，其表达异常与男性不育密切相关[3]。近年来研究发现，哺乳动物和人精浆中也含有丰富、稳定表达miRNA，且男性不育患者精浆miRNA表达谱与正常生育男性存在明显差异，一些精浆miRNA在患者中呈现出显著、稳定的变化，具备作为男性不育新型生物标志物潜能[4]。miR-551b是人第3号染色体编码的一种与细胞增殖和凋亡相关的miRNA，在多种肿瘤中都具有重要的调控作用[5，6]。最新研究显示，miR-551b基因单核苷酸多态性和精子运动能力相关[7]，提示其可能参与了雄性生殖系统发育及精子活力调节，但其在不育男性精浆中表达变化趋势及与男性不育关系目前尚未见报道。因此，本研究拟通过测定男性不育症患者精浆miR-551b水平，探讨其水平变化与男性不育的关系及作为男性不育新型辅助分子标志物的潜能。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取2008年11月～2015年3月在江苏省中医院男科门诊和南京总医院生殖医学中心就诊的男性不育症患者92例，其中非梗阻性无精症患者46例，弱精症患者46例，年龄19～41岁，平均年龄29.12±4.46岁，入组标准为：夫妻性生活正常且未行避孕措施2年以上而未能生育者；排除标准为：患精索静脉曲张、感染、内分泌系统及其他慢性疾病。同期招募已育有1个及以上小孩的正常生育男性34例，年龄22～47岁，平均年龄30±4.89岁，精液参数均在正常范围内。患者及对照在样本采集期间均未服用过任何药物。采集精液前禁欲3～7天，洗净双手，利用自慰法收集精液于干燥消毒的无菌容器中，置37℃恒温箱中温育30 min，液化后先1 500 r/min离心10 min，再以12 000 r/min离心5 min，取上清(精浆)冻存于-80℃待用。

1.2 主要试剂及仪器 水饱和酚(pH=4.3，美国Sigma-Aldrich公司)，去RNA酶的DEPC水(美国Sigma-Aldrich公司)，分析纯级别氯仿、异丙醇、无水乙醇(上海国药化学试剂公司)，dNTP、AMV逆转录酶、5×AMV buffer缓冲液、10× PCR buffer缓冲液、25 mmol/L MgCl2、耐热的rTaq DNA聚合酶(均购自TaKaRa公司)；has-miR-551b逆转录引物、qRT-PCR引物及探针组合试剂盒(美国ABI公司)；人工合成hsa-miR-551b成熟体(上海Invitrogen公司)；2720型普通PCR仪、7300型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；常温低速离心机(B320A型，河北白洋离心机厂)；5418型高速冷冻离心机(Eppendorf公司)计算机辅助精液分析系统(CASA，WLJY-9000精子分析仪，北京伟力公司)；BS60型恒温水浴箱(北京市医疗设备厂)；SAS67120型超纯水机(Millipore)公司；Vortex-Genie2涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 精浆RNA提取：按课题组前期建立的方法[8]，采用酸性水饱和酚-氯仿法进行抽提精浆总RNA，所得RNA沉淀经75 ml/dl无水乙醇洗涤、晾干后溶于20 μl DEPC水并保存于-80℃用于后续miRNA测定。

1.3.2 miR-551b逆转录及实时荧光定量PCR：①cDNA的合成：精浆miR-551b逆转录PCR反应总体系为10 μl，包括10 mmol/L dNTP 1.0 μl，去RNA酶DEPC H2O 3.5 μl，5×AMV酶缓冲液2.0 μl，AMV逆转录酶0.5 μl，RNA样品2.0 μl，miR-551b逆转录引物1.0 μl。逆转录反应条件及程序参数为：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4 ℃保存，每个反应均为1个循环。②实时荧光定量PCR检测miR-551b水平：qRT-PCR反应体系：10×PCR buffer 2.0 μl，10 mmol/L dNTP 0.4 μl，25 mmol/L MgCl21.2 μl、耐热的Taq DNA聚合酶0.3 μl，cDNA 1.0 μl，miR-551上、下游引物及TaqMan探针0.33 μl，最后加ddH2O补足总反应体积为20 μl。qRT-PCR反应条件及程序参数为：95 ℃ 5 min，1个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40个循环。精浆miR-551b表达量的计算按课题组前期建立方法[8]，采用标准曲线及待测样本的Ct值计算。每个样本miR-551b检测过程中设三复孔，同时以DEPC H2O阴性对照。

1.4 统计学分析 数据统计采用SPSS 16.0统计软件和Graphpad 6.0软件。精浆miR-551b含量以中位数(四分位数)[M (P25，P75)]表示，并采用非参数Mann-WhitneyU检验分析、比较三组间精浆miR-551b水平的统计学差异。运用ROC曲线分析miR-551b对男性不育患者的辅助诊断价值。采用Spearman秩相关性分析精浆miR-551b与其他指标间相关性。精浆miR-551b与男性不育症的关系采用逻辑回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精液参数及精浆常规生化指标测定结果 与正常生育组相比，弱精症患者精子密度差异无统计学意义，精子活力降低，差异有统计学意义(P<0.001)；无精症患者精子密度和活力均为零。弱精症、无精症患者精液常规生化标志物除α-糖苷之外，其他指标如酸性磷酸酶、肉毒碱、果糖水平与对照相比差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 精浆miR-551b水平检测 与正常生育组[20.63 (9.59，37.83)fmol/L]相比，弱精症患者精浆中miR-551b含量[62.29(25.22，101.43)fmol/L]显著增加(U=297，P<0.001)，无精症患者精浆中miR-551b含量[4.70(2.41，13.71)fmol/L]显著降低(U=356，P<0.001)，无精症患者精浆miR-551b含量较弱精症患者亦明显降低(U=144，P<0.001)，差异均具有统计学意义。

2.3 ROC曲线分析 运用ROC曲线分析精浆miR-551b水平对于男性不育患者区分的临床价值，结果见图1。精浆miR-551b区分弱精症患者与正常对照组的AUC ROC为0.810(95%CI 0.718～0.902)，最佳诊断截点为49.44 fmol/L，其特异度和敏感度分别为91.2%和65.2%；区分无精症患者与正常对照组的AUC ROC为0.772(95%CI 0.667～0.878)，最佳诊断截点为8.09 fmol/L，其特异度和敏感度分别为82.4%和73.9%；鉴别弱精症患者和无精症患者的AUC ROC为0.932(95%CI 0.885～0.979)，最佳诊断截点为9.02 fmol/L，其特异度和敏感度分别为73.9%和100%。

2.4 男性不育症患者精浆miR-551b与其他指标的相关性 Spearman秩相关性分析结果显示，全部不育症患者精浆miR-551b水平与精子密度(r=0.735)、精子活率(r=0.643)、a级精子比例(r=0.672)、a+b级精子比例(r=0.682)及α-糖苷(r=0.375)呈显著正相关(均P< 0.05)，而与酸性磷酸酶(r=-0.078)，肉毒碱(r=0.067)及果糖(r=-0.25)均无相关性(均P>0.05)。进一步的逐步多元线性回归分析显示，在校正其他相关因素的影响下，不育症患者精浆miR-551b水平则与精子密度呈显著独立相关(β=0.618，P< 0.001，校正r2= 0.368)。

2.5 逻辑回归分析 运用逻辑回归分析精浆miR-551b与男性不育症的关系及其临床价值结果显示，当以正常生育对照为二分类参考变量时，miR-551b是弱精症患者[OR=24.889(95%CI 5.302 ～ 116.843)，P<0.001]和无精症患者[OR=6.303(95%CI 1.316 ～ 30.179)，P=0.021]的危险因素。

3 讨论

目前尚缺乏可靠的分子标志物用于男性不育的辅助诊断，WHO推荐常规精液分析(包括精子密度、活力、形态等)作为男性不育的主要诊断方法，但研究显示仅有40%～60%的男性不育患者表现出精液参数异常，且部分患者精液异常并不能排除正常生育的可能性。精液常规生化标志物，如酸性磷酸酶、肉毒碱、果糖和α-糖苷等，其诊断特异度和敏感度都较差。另有研究显示，精液脱落细胞检测对无精子症具备一定诊断和参考价值，可部分代替睾丸活检，但其临床价值尚需进一步验证[9]，故睾丸活检仍是无精子症患者诊断和治疗的重要手段，但睾丸活检具有侵入性，因此迫切需要新的非侵入性分子标志物用于评价男性不育[10]。最新研究发现，miRNA在睾丸组织和细胞中特异高表达，并在睾丸发育和精子发生过程中发挥重要作用[3]。睾丸生精功能障碍时，miRNA的特异变化能够在精浆中体现，可作为男性不育新的潜在分子标志物。

本研究发现男性不育患者和正常生育对照精浆miR-551b含量显著不同，相较于正常生育对照，弱精症患者精浆miR-551b含量显著增加，而无精症患者精浆miR-551b含量显著降低，提示精浆miR-551b有潜力成为男性不育症的诊断指标。由于无精症患者精子数目明显下降，猜测精浆miR-551b可能来源于精子细胞，而弱精症患者由于精子功能发生改变导致凋亡增加，因此精子细胞中miR-551b释放增多导致精浆中含量增加可能是其精浆miR-551b升高的潜在机制。ROC曲线结果分析显示miR-551b对弱精症和无精症具有较高的诊断价值。同时，对弱精症和无精症鉴别诊断的敏感度达100%，表明精浆miR-551b还有望成为男性不育鉴别诊断的分子标志物。相关性分析显示，miR-551b和精子密度、活率、前向运动(a/a+b级)精子比例密切相关，结合逻辑回归的结果显示miR-551b是弱精症和无精症的危险因素，提示miR-551b可能参与了精子发生和精子运动。事实上，Fernandez等[7]报道miR-551b单核苷酸多态性和公牛精子前向运动相关，进一步佐证了miR-551b参与了精子活动能力的调节。另有研究指出，miR-551b可调节参与TGF-β通路、细胞增殖和凋亡相关的靶基因表达[11]，而TGF-β转录因子基因家族在睾丸发育和精子发生中有重要的调节作用[12]，因此推测miR-551b可能通过参与TGF-β通路调节在精子发生中发挥重要作用。

我们的研究仍存在一定局限性。首先，研究样本量相对较少，后续的研究中应需扩大样本量；第二，我们仍需对miR-551b的靶基因及其在精子发生和运动中的功能进行研究，以期揭示其在男性不育症中的参与机制；另外，精浆miR-551b的具体来源、存在形式及是否具备一定的生理病理功能目前尚不清楚。最新研究显示，精浆miRNA可包裹于微囊泡如外泌体(exosome)中，特定细胞通过主动分泌exosome并以其为天然生物载体携带miRNA进入受体细胞发挥生理病理功能[13，14]。因此，对精浆miR-551b的可能来源、存在形式及可能去向进行深入研究可为揭示精浆miRNA生理功能、男性不育发生潜在分子机制提供新的方向。

综上所述，精浆miR-551b在弱精症患者中含量增加，在无精症患者中含量降低，并与精子密度、活率、前向运动密切相关，且miR-551b是弱精症和无精症的危险因素，表明精浆miR-551b有潜力成为新的男性不育诊断和鉴别诊断分子标志物，同时，上述结果为男性不育的分子机制研究提供了新的思路和理论依据。