2型糖尿病患者外周血miRNA表达谱差异研究*

2018-12-13郭宜晨鲁亚静钟伟传陈雪艳郭广洲

现代检验医学杂志 2018年6期

郭宜晨，鲁亚静，钟伟传，陈雪艳，郭广洲

(1.北京大学深圳医院，广东深圳 518036；2.深圳市梓健生物科技有限公司，广东深圳 518000；3.深圳市龙华区人民医院，广东深圳 518109)

糖尿病是当前威胁全球人类健康的最重要的非传染性疾病(noncommunicable diseases，NCD)之一。在我国患病人群中，以2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)为主(占90.0%以上)。目前，T2DM的病因和发病机制尚不明确，以胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)伴随胰岛β细胞功能减退为病理生理特征，常伴有多种并发症，对机体各器官组织造成伤害，若能在发病前通过检测某些指标对T2DM的患病风险进行预测，便可通过外界干预手段早期预防、降低患病风险。微RNA(miRNA)是一类内源性的具有调控转录后水平基因表达的非编码RNA，在T2DM患者胰岛细胞功能衰竭、IR及其引发的并发症的发生发展中起着重要的作用。因血清miRNA变化早于靶基因的变化、具有体液中的稳定性、细胞间的穿梭性以及组织来源特异性的特点，非常适合作为生物标志物用于疾病的预警和早期诊断[1]。本研究以T2DM患者、1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)患者、健康受试者外周血血清为研究对象，旨在为筛选出T2DM的miRNA分子标记物奠定基础，从而为T2DM的预防、早期诊断和治疗方案提供指导。

1 材料与方法

1.1 研究对象所有受试者外周血血清(T2DM患者20例、T1DM患者6例、健康受试者20例)均来自北京大学深圳医院和深圳市龙华区人民医院，均签署了知情同意书，并通过医院伦理委员会的审核。T2DM患者、T1DM患者和健康受试者诊断分类依据1999年世界卫生组织规定糖尿病诊断及分型标准[2]。

本研究中将所有受试者分为3组：T2DM组20例，其中男性14例，女性6例，年龄49.5±12.9岁；T1DM组6例均为男性，年龄24±2.8岁；健康受试组20例(对照组)，其中男性10例，女性10例，年龄50.5±17.5岁。每组每例取等体积血清制备混合样提取总RNA以及根据性别，每例取等体积血清制备混合样提取总RNA。

1.2 主要试剂与仪器 GeneChipTMmiRNA 4.0 Array，FlashTagTMBiotin HSR RNA Labeling Kit，GeneChipTMExpression Hybridization Controls，GeneChipTMHybridization Wash and Stain Kit购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，GeneChip Scanner 3000 7G，Fluidics Station，GeneChip Hybridization Oven 645购自affymetrix，GeneAmp PCR System 9700购自ABI，TC型基因扩增仪(LifeECO)购自杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 外周血血清总RNA的获得：参照TRIzol®LS Reagent说明书提取各组样本外周血血清总RNA。

1.3.2 miRNA 4.0芯片分析：采用GeneChipTMmiRNA 4.0 Array分析3组受试者外周血血清(T2DM组、T1DM组、对照组)miRNA表达谱差异，并对差异miRNA进行靶基因预测和靶基因信号通路富集分析(KEGG)。

2 结果

2.1 GeneChipTMmiRNA 4.0 Array筛选结果 GeneChipTMmiRNA 4.0 Array扫描数据经标准化后计算标准信号值的变化倍数(FC)，差异miRNA筛选条件为t检验，P<0.05且|FC|>1.1。

T1DM组与对照组相比，T1DM患者血清中有23个miRNA上调和37个miRNA下调且具有统计学差异；T2DM组与对照组相比，T2DM患者血清中有18个miRNA上调和23个miRNA下调且具有统计学差异；T2DM组与T1DM组相比，T2DM患者血清中有23个miRNA上调和18个miRNA下调且具有统计学差异。其中T2DM组分别与对照组、T1DM组相比，hsa-miR-505-3p和hsa-miR-548an均上调，hsa-miR-296-3p，hsa-miR-3160-5p，hsa-miR-33a-5p，hsa-miR-572和hsa-miR-96-5p均下调；T2DM组、T1DM组分别与对照组相比，hsa-miR-3168，hsa-miR-499a-5p，hsa-miR-520a-3p，hsa-miR-6775-3p和hsa-miR-6819-3p均上调，hsa-miR-1229-5p，hsa-miR-513c-3p，hsa-miR-670-3p和hsa-miR-7112-5p均下调，见表1。

2.2 差异miRNA的靶基因预测对有别于T1DM组和对照组的7个miRNA(hsa-miR-505-3p，hsa-miR-548an，hsa-miR-296-3p，hsa-miR-3160-5p，hsa-miR-33a-5p，hsa-miR-572和hsa-miR-96-5p)进行相关靶基因预测，预测结果共有2 318个不同的靶基因。上述7个miRNA预测到靶基因数依次为247，1185，123，431，196，14和453个。与胰岛素抵抗和T2DM相关的差异表达miRNAs靶基因，见表2。

2.3 靶基因信号通路富集分析利用KEGG数据库对靶基因进行Pathway分析，与胰岛素抵抗相关的基因共计30个。其中MTOR，SLC2A2，PRKCE，IRS2，IRS1，MAPK8，MAPK10 7个基因亦与2型糖尿病有关，见表3。

3 讨论

T2DM的发生是多基因作用的结果，胰岛素抵抗贯穿其发生发展全过程。本研究通过Pathway分析，筛选出7个基因可能与T2DM胰岛素抵抗相关。其中MTOR，IRS2，IRS1，MAPK8与T2DM胰岛素抵抗的关系已有一些文献报道证实[3～9]，而SLC2A2，MAPK10，PRKCE这3个基因与T2DM胰岛素抵抗的关系的研究未见相关报道证实。SLC2A2基因编码GLUT2蛋白，IR-HepG2细胞GLUT1和GLUT2表达量上调可加速葡萄糖转运进入肝细胞中并增加糖原合成来增强IR-HepG2细胞的胰岛素敏感性[10]。MAPK10基因又称JNK3基因，选择性的在脑、睾丸和胰腺β细胞中表达。Raddatz等[11]的研究发现PRKCE可改善饮食引起的糖耐量受损。差异表达miRNA中hsa-miR-572经qRT-PCR检测结果在T2DM、糖尿病前期和健康对照组中下调[12]，与本研究中的结果一致，但靶基因中未预测到与T2DM胰岛素抵抗有关的基因。与正常组、模型组比较，二甲双胍组rno-miR-96-5p上调，与本研究中的结果一致[13]，靶基因预测中的MTOR，PRKCE，IRS1与T2DM胰岛素抵抗有关。而有关hsa-miR-505-3p，hsa-miR-548an，hsa-miR-296-3p，hsa-miR-3160-5p和hsa-miR-33a-5p的研究未见相关报道。本研究中筛选出的7个miRNA(hsa-miR-505-3p，hsa-miR-548an，hsa-miR-3160-5p，hsa-miR-33a-5p，hsa-miR-296-3p，hsa-miR-572和hsa-miR-96-5p)，7个基因(MTOR，SLC2A2，PRKCE，IRS2，IRS1，MAPK8，MAPK10)可能与T2DM胰岛素抵抗相关，进而为T2DM胰岛素抵抗的相关研究提供理论基础。但通过芯片筛选出的差异表达miRNA仍需后期的qRT-PCR验证，是否对T2DM胰岛素抵抗具有指示作用，作为其标志物，有待验证。筛选出的靶基因是否对T2DM胰岛素抵抗具有预测价值，亦需要后期体内外实验和临床研究进一步验证。