谷氨酸脱氢酶在肝外胆管癌患者肿瘤组织中的表达及其临床意义*

侯建峰，杨亚明，王 莉，王 莉

(1.榆林市第一医院 a.肝胆外科；b.体检中心B超室，陕西榆林 719000；2.宝鸡市第二中医医院内科，陕西宝鸡 721300)

肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)是一种原发于肝外胆管上皮的恶性肿瘤，是常见的胆道梗阻性疾病之一，手术切除率低，一般预后较差[1，2]。谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，GLDH)主要分布于肝细胞，正常情况下GLDH表达水平很低，在肝脏疾病尤其涉及肝细胞线粒体损害时其表达水平及活性显著升高[3]。目前研究认为GLDH在谷胱甘肽生成中起着关键作用，是维持细胞氧化还原平衡的重要分子，与肿瘤细胞的生长和增殖密切相关[4～6]。本研究观察160例ECC患者肿瘤组织GLDH表达情况，比较不同表达水平患者平均生存时间，旨在讨论ECC患者肿瘤组织GLDH表达与患者临床病理特征及预后的关系，为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 经我院伦理委员会批准，收集2005年1月～2015年12月于我科手术切除治疗的160例ECC患者纳入研究作为病例组，所有患者均在未进行化疗及放疗之前经病理切片确诊，其中男性110例，女性50例，年龄37～69岁，平均年龄63岁。其中肿瘤表达CD34+患者60例，CD34-表达100例；病理分级，高分化腺癌60例，中分化腺癌52例，低分化腺癌48例；肉眼及病理切片可见血管血栓29例，血管侵犯131例；淋巴结转移51例，无淋巴结转移109例，包膜及神经侵犯55例，无神经侵犯105例。选择同期胆管正常组织标本30例作为对照，均经病例确诊无癌细胞浸润。

1.2 试剂和仪器 罗氏Bench Mark XT免疫组化染色机(瑞士Ventana公司)，普通光学显微镜(日本尼康)，相关试剂及GLDH鼠抗人单克隆抗体(美国Santa Cruze公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学检测GLDH表达水平：所有标本由10 g/dl中性甲醛固定，常规石蜡包埋，5 mm切片，采用免疫组织化学EnVision二步法检测GLDH表达情况。阳性细胞计数评分方法：无阳性细胞为0分，阳性细胞<10%为1分，阳性细胞10%～35%为2分，阳性细胞35%～70%为3分，阳性细胞数>70%为4分。染色强度评分方法：无着色为0分，淡黄色为1分，黄色或深黄色为2分，棕色或棕褐色为3分。将阳性细胞计数评分与染色强度评分相乘，0分为阴性(-)，≥1分为阳性，其中1～3分为低表达(+)，4～7分为中表达，8～12分为高表达。

1.3.2 随访：所有患者均接受规范化随访，后续检查包括腹部超声，X线胸片，肝功能试验，血清CA199和CEA水平监测。手术后前两年每隔2月检查1次，之后每3个月检查1次。术后每6个月进行对比增强CT或MRI检查。

1.4 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件对所有数据进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验或Fisher精确检验；采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验评估对比分析存活概率。采用Cox比例风险模型进行单因素及多因素变量分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GLDH在ECC患者肿瘤组织中表达情况 见图1。

(1.放大200倍；2.放大400倍)A：GLDH低表达；B：GLDH中表达；C：GLDH高表达

GLDH表达主要位于细胞浆和细胞膜上，在ECC组织中GLDH染色呈斑片状或弥漫性分布，正常胆管组织中GLDH染色呈点状分布。本研究所有ECC组织标本及正常胆管组织标本未见阴性表达。160例ECC患者肿瘤组织标本GLDH低表达、中表达和高表达分别有45例(28.1%)，57例(35.6%)和58例(36.3%)；30例对照组胆管组织标本GLDH低表达、中表达和高表达分别有22例(73.3%)，7例(23.3%)和1例(3.3%)，两组比较差异具有统计学意义(χ2=24.590，P=0.000)。

2.2 GLDH表达与ECC患者临床病理特征的相关性 见表1。肿瘤组织GLDH表达强度与ECC患者年龄、CD34表达情况、细胞分化程度及有无神经浸润均密切相关(χ2=12.145～158.075，均P<0.05)，与患者性别、有无包膜侵犯、有无血管侵犯及有无淋巴转移无明确相关性(χ2=0.832～2.319，均P>0.05)。

表1GLDH表达与ECC患者临床病理特征的相关性[n(%)]

2.2 GLDH表达与ECC患者预后的关系 见图2。绘制各主要参数Kaplan-Meier曲线，肿瘤组织GLDH低表达、中表达、高表达患者的平均生存时间分别为44.3个月，26.0个月和11.6个月，Log-rank检验提示3组生存曲线差异存在统计学意义(χ2=18.367，P=0.001)。另外，患者发病年龄、CD34表达、细胞分化程度、包膜侵犯及神经浸润等参数也同患者生存时间密切相关(χ2=12.684～38.670，均P<0.05)。进一步采用Cox比例风险模型对单因素分析P<0.05的参数进行多因素分析，结果显示肿瘤组织GLDH高表达、CD34阳性、神经浸润和细胞分化程度低均是ECC患者预后不良的独立危险因素(HR=2.022～11.647，均P<0.05)，见表2。

表2 多变量Cox比例风险模型分析结果

3 讨论

越来越多研究证据表明，GLDH作为谷氨酰胺代谢的关键酶，在肿瘤生长和转移过程中发挥关键作用，GLDH可将谷氨酰胺分解生成ATP，支持肿瘤细胞生长，并通过合成谷胱甘肽减轻肿瘤细胞的氧化应激反应[4～7]。还有研究发现多种致癌基因和肿瘤抑制剂，包括p53，人去乙酰化酶4，雷帕霉素靶蛋白复合体1等也通过参与谷氨酰胺代谢调控过程发挥作用[8～10]。

图2 各参数Kaplan- Meier曲线

目前，GLDH已成为癌症治疗研究的热门作用靶点，多项研究结果显示，GLDH抑制剂可通过降低GLDH活性，抑制癌细胞增殖和肿瘤的生长[11，12]。近年来，相继有研究证实GLDH参与肝癌、胶质瘤、结直肠癌等多种肿瘤疾病发生发展的病理生理过程[13，14]。因此，鉴于GLDH在肝胆组织中分布及活性远高于机体其他器官，笔者认为有理由推测ECC患者肿瘤组织GLDH表达与疾病进展相关。

本研究采用免疫组织化学方法检测160例ECC肿瘤组织及30例胆管正常组织GLDH表达情况，研究显示，与正常胆管组织相比，GLDH在ECC组织中呈明显高表达趋势。肿瘤组织GLDH表达强度与ECC患者年龄、CD34表达情况、细胞分化程度及有无神经浸润均密切相关，而与患者性别、有无包膜侵犯、有无血管侵犯及有无淋巴转移无明确相关性。同时，本研究分析比较肿瘤组织GLDH不同表达水平患者术后预后情况，结果显示GLDH低表达、中表达、高表达患者生存曲线差异存在统计学意义，GLDH高表达患者平均生存时间显著降低。进一步Cox多因素分析结果显示肿瘤组织GLDH高表达是ECC患者预后不良的独立危险因素。

综上所述，ECC患者肿瘤组织GLDH表达显著增高，可能是ECC手术患者的一个重要预后指标。GLDH有望成为ECC治疗的新靶点，期待更多研究进一步证实。