菟丝子提取物对自然衰老小鼠学习记忆能力及肝和脑组织ATP酶活力的影响

刘海云 纪玉龙 何志坚

(江西中医药大学基础医学院，江西 南昌 330004)

衰老是一个复杂多变的生物学过程，随着年龄的增长，机体在成年以后即使在正常状态下也会发生一系列形态结构的变化和机体功能的减退，并逐渐走向死亡的不可逆转的现象〔1〕。中药菟丝子是一年生攀缘性的草本寄生性种子植物，是一种常用补阳药物，性平、味辛甘，归肾、肝、脾经，具有补肾益精、养肝明目、固精缩尿、安胎止泻的功效〔2〕。自由基学说是衰老的一个讨论热点，本实验观察中药菟丝子对自然衰老小鼠学习记忆能力及过氧化脂质(LPO)水平、过氧化氢酶(CAT)活性和肝脑组织中ATP酶活力的影响并分析其抗衰老作用机制。

1 材料与方法

1.1动物 昆明种老龄小鼠(12～14月龄)40只,青龄组小鼠(3～4月龄)10只，小鼠由江西中医药大学实验动物中心提供，雌雄各半，许可证号SYXK(赣)2015-0026。室温20 ～ 22 ℃，空气新鲜，通风良好，小鼠雌雄分笼固体饲料喂养,自由饮水，正式开始实验前适当饲养7 d左右。

1.2试剂 CAT试剂盒、LPO试剂盒、ATP酶活力试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，批号依次为20150121、20150217、20150214。中药菟丝子购于南昌开心人大药房。

1.3仪器 微量进样器(德国Eppendorf公司),恒温水浴锅(金坛市荣华仪器制造有限公司)，AdventurerTM电子天平(奥豪斯国际贸易有限公司)，TGL-16G型台式高速离心机(上海市实验仪器总厂)，TECAN酶标仪sunrise(奥地利TECAN公司)

1.4菟丝子提取物的制备〔3〕称取菟丝子中药250 g，加入2 000 ml水浸泡120 min，至菟丝子药材微胀，微火煎煮2次，每次煎煮时间30 min，过滤2次提取液合并一起，至水浴锅中浓缩至生药浓度为0.4 g/ml，放于西门子冰箱冷藏，备用。

1.5动物分组与给药 昆明种老龄小鼠，随机分为衰老模型组、低、中、高剂量给药组(菟丝子100、200、300 mg·kg-1·d-1剂量组各10只；青龄组为正常对照组。菟丝子低剂量、中剂量和高剂量每天灌胃给药1次,正常对照组和衰老模型组给予相同体积的生理盐水灌胃，持续7 w。

1.6学习记忆能力测试 Y迷宫行为学的观察参照文献〔4〕。在MG-2型Y迷宫(规格100 mm×150 mm×250 mm)内，分安全区(A)、电击区(B)和起步区(C)。在实验测试时接通电流给予小鼠电刺激，小鼠从C区接受电击刺激后，能一次性从C区直接跳到A区为正确反应，否则属错误反应。通过观察它能否有效避开并正确找到安全区来判断小鼠的学习和记忆能力。实验小鼠最后一次给药60 min后,开始进行学习记忆能力训练，首先把小鼠放入Y迷宫并让其适应6～8 min，再把小鼠放进起步区，接通电流，记录小鼠接受电击后的反应，并记录其结果。注意两次电击训练之间让小鼠休息1 min。如果连续训练10次都对或者9次正确即为小鼠已经学会空间辨认。达标时所需的训练次数作为学习成绩。1 d后用相同的训练方法再训练，训练时的错误次数记为记忆成绩。

1.7肝脑组织及血清的制备 最后一次给药0.5 h后眼眶取血，放于离心机3 000 r/min离心10 min，微量加样器吸取上清液备用。取血后的小鼠迅速放置于冰上，快速取出肝脏和脑组织,用4℃的生理盐水反复冲洗2～3次，洗掉表面的残血，滤纸拭干后,称其重量,剪碎组织放入匀浆瓶中，按重量体积比加9倍生理盐水匀浆10 min，配成10%脑组织和肝脏匀浆液,然后以1 500 r/min离心10 min,取其上清液，再用生理盐水把上清液稀释为浓度为2%组织匀浆，-70℃保存备用。

1.8肝脑组织中Ca2+-Mg2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活力的测定 取稀释好的组织匀浆按试剂盒步骤进行操作。

1.9统计处理 采用SPSS17.0软件进行LSD法分析。

2 结 果

2.1各组学习记忆能力 衰老模型组与正常对照组相比，学习达标次数和记忆错误次数均增多(P<0.01)；给药组与衰老模型组相比，学习和记忆错误次数减少，以中、高剂量组效果明显(P<0.05，P<0.01)。见表1。

2.2各组肝和脑组织中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力 与正常对照组比较，衰老模型组ATP酶活力显著降低(P<0.05，P<0.01)；与衰老模型组比较，低、中、高剂量给药组脏、脑组织ATP酶活力均明显升高(P<0.05，P<0.01)。见表2,表3。

表1 各组学习记忆能力次)

与正常对照组比较：1)P<0.01；与衰老模型组相比：2)P<0.01，3)P<0.05；表4同

表2 各组肝组织ATP酶活力

与正常对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组相比：3)P<0.05，4)P<0.01；表3同

表3 各组脑组织ATP酶活力

2.3各组血清中CAT活力、LPO含量 与正常对照组相比，衰老模型组血清中CAT活力均显著降低而LPO含量显著升高(P<0.01)；与衰老模型组比较，低、中、高剂量给药组血清中CAT活力均显著升高而LPO含量显著降低(P<0.05，P<0.01)。见表4。

表4 各组血清中CAT活力、LPO含量

3 讨 论

自由基学说是目前衰老学说机制中被认可的一种〔5〕，该学说提出了衰老与自由基关系密切，在正常生理活动过程中细胞会产生自由基，自由基生成过多不能及时清除而导致自由基不断堆积，生成大量的过氧化物，最终加速了细胞衰老并可能进一步导致其死亡〔6〕。本实验证实中药菟丝子可以清除产生的过多自由基，直接或间接降低了自由基对机体的损害,从而保护机体组织因抗氧化性物质消耗造成的损伤,从而达到抗衰老的作用。 ATP酶是一种辅酶，作为能量产生的必需生理物质，可参与机体三大物质(糖、蛋白质、脂肪)及核酸、核苷酸等代谢过程，又可以改善机体代谢。因此ATP酶的活力可准确衡量细胞代谢相关的生命活动，是衡量细胞衰老的最重要指标之一。本文表明，处于自然衰老状态的小鼠脑组织中Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPsae活性呈下降的趋势，这与文献报道基本一致〔7〕。Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase是细胞膜上的一类蛋白质，它可以调节细胞内外离子的浓度，可以将细胞内的钙离子运输到细胞外，从而保持细胞内、外处于钙稳定状态。随着年龄增大，Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性降低，势必会引起这一稳态的失衡，不能保持细胞内低钙离子浓度，导致细胞内钙离子浓度超标，加速了细胞的衰老〔8〕，虽然肝脑组织中ATP酶活性受多方面因素的影响，但在降低ATP酶活性方面自由基损伤是最重要的指标之一。本文结果表明，菟丝子取物对自然衰老小鼠肝脑组织ATP酶活性有明显的增强效果，从而进一步起到延缓衰老的作用。

CAT存在于细胞膜上，可以对抗自由基，将体内H2O2分解为水而被清除，从而降低体内自由基的生成而减少自由基堆积〔9〕。LPO可以让细胞功能下降，是细胞膜上不饱和脂肪酸与氧自由基相互作用生成的脂质过氧化产物，破坏细胞膜的结构，从而使细胞失去活性，导致机体细胞死亡〔10〕。正常情况下，机体代谢过程中由于抗氧化能力降低造成体内自由基物质增加，包括H2O2和羟自由基等，自由基可以氧化细胞膜中不饱和脂肪酸，从而形成过氧化脂质加速机体的衰老〔11〕。本实验结果表明菟丝子提取物可提高体内抗氧化酶活性，减少脂质过氧化产生，增强体内自身抗氧化能力，对延缓衰老能起到一定的积极作用。