APP下载

高效液相色谱—串联飞行时间质谱法检测安神类保健食品中非法添加物

2018-12-12宁高媛惠高利珍

食品与机械 2018年10期
关键词:添加物青藤响应值

康 宁高媛惠高利珍

KANG Ning1,2 GAO Yuan-hui2 GAO Li-zhen1

(1. 太原理工大学,山西 太原 030024;2. 中华人民共和国太原海关,山西 太原 030024)

(1. Taiyuan University of Technology, Taiyuan, Shanxi 030024, China; 2. Taiyuan Customs District, Taiyuan, Shanxi 030024, China)

保健食品属于食品的一个分支,能调节人体的机能,适用于特定人群使用,但不以治疗疾病为目的[1-2]。随着公众健康保健意识的不断增强,对保健食品的需求十分旺盛。为了使保健品达到宣传的预期效果,不法企业选择向保健品中添加具有治疗效果的药物[3-4],以此来赚取高额利润。目前保健食品中呈现出的非法化学药物添加,有以下现象:添加物的来源不明[5-8],非法添加药物的剂量随意[9],非法添加药物的兼容性不明确[10];而且非法添加现象较为严重。如果消费者长期服用这些含有违禁化学物质的保健食品,会直接影响身体健康,极大地损害了消费者的身心健康和经济利益。

近年来,对于降压类、降糖类及减肥类等保健品中非法添加物的研究进展较多[11-13],国内外文献对安神类保健品非法添加的研究也有报道[14-16]。目前中国食药总局发布了保健食品中非法添加物目录,其中青藤碱、罗通定、扎来普隆、文拉法辛、褪黑素5种在名单内,都属于国家严格监管的一类药品,如果使用不当或滥用将造成严重不良后果,如出现困倦、乏力、头晕,严重时还可能导致昏迷[17]。然而,目前对青藤碱、罗通定、扎来普隆、文拉法辛、褪黑素等5种安神类药物作为保健品的非法添加物的检测方法尚未见到,仅有对药物本身检测方法的研究[18-22]。

液相色谱—串联飞行时间质谱法(LC-Q-TOF-MS)是近几年发展起来的一种高端串联质谱技术,在药物分析、食品分析、环境分析等众多领域得到广泛的应用[23-24],高分辨质谱仪较低分辨质谱仪分析速度快、灵敏度高、分辨率高、选择性强,特别是对于复杂样品的分析与鉴定有不可替代的作用。目前对上述5种安神类药物的研究均采用的是普通液相色谱串联质谱仪,尚未见高分辨质谱仪应用于保健品中非法添加检测方法的研究[25-27]。

本研究拟采用LC-Q-TOF-MS检测安神类保健食品中的非法添加物,并探索试验条件及优化检测参数设定,以期建立出一种快速、高效、灵敏的安神类保健食品中非法添加物(青藤碱、罗通定、扎来普隆、文拉法辛、褪黑素)的检测方法,为中国保健食品中违法添加安神类药物提供检测依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

改善睡眠类的保健食品:胶囊A (0.35 g/粒)、口服液B(15 mL/支)、胶囊C(0.5 g/粒)、胶囊D(0.5 g/粒)、茶剂E(4 g/袋)、胶囊F(0.35 g/粒),研碎,尽量使样品均匀,正规药店购买;

乙腈、甲醇:色谱纯,美国Fisher 公司;

乙酸铵:分析纯,天津市化学试剂厂;

试验用水均为去离子水;

试验所需的标准品及其相关信息如表1所示。

表1 5种化合物标准品及其相关信息

1.2 主要仪器设备

液相色谱仪:Agilent Technologies 1290型,美国安捷伦科技有限公司;

飞行时间质谱仪:Agilent Technologies 6540型,美国安捷伦科技有限公司;

电子分析天平:XS204型,瑞士Mettler公司;

涡旋混合器:945617型,美国TALBOYS公司;

超声波:KQ-500DB型,昆山舒美超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 定性分析中色谱条件的优化

(1) 1 000 mg/L非法添加物单标准储备溶液:分别称取按质量折算为100%的标准品(纯度≥ 99.2%)10.00 mg于10 mL的容量瓶中,青藤碱、文拉法辛、扎来普隆用甲醇溶解并稀释至刻度,罗通定用三氯甲烷溶解并稀释至刻度,褪黑素用70%甲醇溶解并稀释至刻度,将配置好的各个单标准溶液于-18 ℃下保存。

(2) 1 000 mg/L标准溶液:移取各标准储备溶液,用甲醇溶液配置,再用甲醇稀释成10,100,500,800,1 000 μg/L的混合标准系列浓度溶液。选择 Agilent C18色谱柱(1.9 μm,2.1 mm×50 mm);将提前配制的 5 种非法添加物(青藤碱、罗通定、扎来普隆、文拉法辛、褪黑素)的混标溶液进样,流量0.3 mL/min;进样量10 μL;柱温30 ℃;按表 2 进行梯度洗脱;流动相 A 为甲醇,流动相 B 分别设定为水、0.1%(体积分数)甲酸溶液、含 20 mmol/L乙酸铵的0.1%(体积分数)甲酸溶液外,其他条件同1.3.1(1),进行3次试验,选择 5 种化合物响应值最高的为试验所选B路流动相。

表2 梯度洗脱程序

1.3.2 定性分析中质谱条件的优化 离子源为电喷雾离子化器(ESI);检测方式为正离子;离子源喷射电压5.5 kV,毛细管电压135 kV;脱溶剂气温度500 ℃,脱溶剂气流量800 L/h。扫描方式为一级、二级全扫描,全扫描数据采集可以得到化合物的一级母离子精确质量数,以及二级定性离子对的精确质量数。

1.3.3 定量分析方法

(1) 检出限和定量限:取1 mg/L的5种非法添加物的混合标准溶液贮备液,用甲醇稀释成一定质量浓度的溶液后测定各化合物的信噪比,依据检出限为3倍信噪比(S/N=3),定量限为10倍信噪比(S/N=10),计算出该方法的检出限和定量限。

(2) 线性关系考察:取安神类非法添加物混合标准溶液,用甲醇稀释配制成浓度梯度溶液为10,100,500,800,1 000 μg/L,浓度由低至高依次进行LC-Q-TOF/MS分析。以峰面积(Y)为纵坐标,浓度(X)为横坐标,绘制标准曲线。

(3) 回收率和精确度:取空白的阴性样品1.0 g于3支50 mL离心管中,并在每支试管中分别加入适量的罗通定、青藤碱、文拉法辛、褪黑素、扎来普隆,用甲醇稀释至10 mL,配制成含有这5种非法添加物浓度为10.0,50.0,100.0 μg/L 3个加标溶液,超声20 min,静置10 min后,取其上清液过0.22 μm 微孔滤膜,然后进入该仪器进行分析,平行测定6次。根据外标法计算这5种非法添加物的回收率,并计算该方法的精确度。

1.3.4 样品含量的测定

(1) 样品预处理:对于胶囊剂,取10粒胶囊,取出内容物,将胶囊壳剪碎,与内容物混匀并研磨;对于茶剂,取少量进行研磨;对于口服制剂,量取1次口服剂量。

(2) 样品提取:准确称取1.00 g(精确至 0.01 g)试样至50 mL离心管中,加入10.00 mL甲醇溶液超声提取20 min,静止10 min后,取上层清液,用0.22 μm微孔滤膜过滤,备用。

(3) 根据试验所建立的方法,对待测样品中的 5 种非法添加物进行定性定量分析。

2 结果与讨论

2.1 定性分析中检测条件的优化

2.1.1 流动相的优化 由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态电离,因此流动相的组成和添加剂除了影响分析物的保留时间和峰形外,还会影响分析物的离子化效率,从而影响到目标化合物的检测灵敏度。本试验分别采用甲醇和水,甲醇和 0.1%甲酸,甲醇和含20 mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸溶液作为流动相,考察不同流动相组成对分析物峰形及离子化效率的影响,5 种化合物在不同流动相的条件下所对应的响应值见表 3。如图 1 所示,图1(c)中青藤碱的峰形最好、响应值最高,因此青藤碱的流动相选甲醇和含20 mmol 乙酸铵的0.1%甲酸溶液。而罗通定、文拉法辛、扎来普隆在3种不同流动相下的色谱图分析结果同青藤碱类似,因此,罗通定、青藤碱、文拉法辛、扎来普隆的流动相都选用甲醇和含20 mmol/L 乙酸铵的0.1%甲酸溶液。

由图2可知,褪黑素在后2个图中峰形不够好,但仍然是在图2(c)中响应值最高,因此褪黑素的流动相依然选择甲醇和含20 mmol/L 乙酸铵的0.1%甲酸溶液。

图1 青藤碱在3种流动相条件下的色谱图

图2 褪黑素在3种流动相条件下的色谱图

由3可知,0.1%甲酸溶液和含20 mmol/L乙酸铵的0.1% 甲酸溶液作为流动相B 时,5 种非法添加物的响应值远远高于以水为流动相B的;而含20 mmol/L 乙酸铵的0.1% 甲酸溶液又比0.1% 甲酸溶液的响应值较好。因此对5种非法添加物的流动相都选用甲醇和含20 mmol/L乙酸铵的0.1%的甲酸溶液。

2.1.2 碰撞能量的优化 碰撞能量对一级母离子打碎成为二级质谱离子起着至关重要的作用,通过改变碰撞能量的大小,使得母离子以不同的动能与碰撞池中的碰撞气相撞,动能转化为内能,转化的越多,越有利于母离子打碎。对每一种化合物来说,其母离子只能打碎成一些特定的二级质谱离子,在这些碎片离子中,找出该化合物的2个响应值最高的二级碎片离子,作为该化合物的特征离子对,即该化合物的定性离子对。

表3 5种非法添加物在3种流动相B下对应的响应值

在离子源为电喷雾离子化器(ESI);检测方式为正离子;离子源喷射电压 5.5 kV,毛细管电压 135 kV;脱溶剂气温度500 ℃,脱溶剂气流量800 L/h。锥孔电压135 kV和碰撞能量(10~35 eV)进行了优化。经过一级、二级全扫描模式,全扫描数据采集可以得到化合物的一级母离子精确质量数,以及二级定性离子对的精确质量数。通过对试验过程中的碰撞能量进行梯度设定,检测目标化合物的定性离子对响应值最高时碰撞能量,例如青藤碱在不同的碰撞能量梯度下的二级质谱图见图 3。

图3 青藤碱在碰撞能量梯度下的二级质谱图

从图3可以看出,随着碰撞能量的增加,青藤碱中的一部分二级碎片离子的响应值越来越高,逐渐从该化合物的全部二级碎片离子中突显出来。181.064 6和207.044 3 2个二级碎片离子的响应值较高。因此,对于青藤碱,宜以181.064 6和207.044 3 作为该化合物的定性离子对。由图 3还发现,对于 181.064 6在碰撞能量为 30 eV 的条件下,响应值最高,对于207.044 3在碰撞能量为35 eV时,响应值最高。

同理根据 5 种非法添加物的二级质谱图,对5种非法添加物的定性离子对及最优碰撞能量进行了统计,见表4。

由表 4 可以看出,5 种非法添加物的一、二级质谱离子的质量数都精确到了小数点后4位,具有超高精确度和准确度,且 5 种非法添加物的保留时间为 2.0~3.2 min,分析速度快。

2.1.3 建立5种非法添加物检测的方法参数 通过所确立最佳的试验条件设置的各试验参数,建立了安神类保健品5 种非法添加物的数据库。优化后的方法参数如表 5 所示。

2.2 定量方法学考察

2.2.1 检出限和定量限测定 取混合标准溶液贮备液,用甲醇稀释成一定质量浓度的溶液后测定各化合物的信噪比,依据检出限为3倍信噪比(S/N=3),定量限为10倍信噪比(S/N=3),结果如表6所示。

由表6可以看出,5 种非法添加物的检出限≤0.9 μg/L,定量限都≤3 μg/L,说明所建立的试验方法灵敏度高、准确度强。

表4 质谱条件的优化结果

表5 方法参数一览表

表6 5种化合物的检出限和定量限

2.2.2 线性关系考察 分别精密取各标准储备液适量,用甲醇稀释成10,100,500,800,1 000 μg/L的混合标准系列浓度溶液,用液相色谱—串联飞行时间质谱的试验方法进行测定。以化合物一级精密质量数的峰面积(Y)对相应质量浓度(X)建立标准曲线(图4),线性关系如表7所示。

由图4和表7可知,5种化合物在10~1 000 μg /L时线性关系良好,相关系数>0.99。进一步的证明本试验所建立的方法精密度高、灵敏度强。

2.2.3 回收率与精密度 分别取空白的阴性样品1.0 g于50 mL离心管中,并在每支试管中分别加入适量的罗通定、青藤碱、文拉法辛、褪黑素、扎来普隆,用甲醇稀释至10 mL,以配制成含有这 5种非法添加物的10.0,50.0,100.0 μg/L 3个浓度的加标溶液,每个浓度需添加6次,超声20 min,静置10 min后,取其上清液过0.22 μm微孔滤膜,然后进行分析。根据外标法计算这5种非法添加物的回收率,并计算该方法的精确度,如表8所示。

图4 5 种化合物的标准曲线

化合物线性回归方程R2青藤碱 y=33.594x-24.5610.998 7罗通定 y=28.334x+27.2140.997 3文拉法辛y=1.583 7x+52.2350.995 9褪黑素 y=13.583x-299.870.994 7扎来普隆y=7.943 6x-473.190.990 2

表8 5种化合物的回收率与精密度

由表8可以看出,空白样品中的平均回收率为92.8%~110.1%,精密度为0.9%~1.8%。更加进一步地证明本试验所建立的方法灵敏度高、选择性强。

2.3 样品测定

采用本研究的方法对市售的6种安神类保健品进行检测,只有胶囊D检出了青藤碱,经定量分析测得青藤碱含量为1.656 mg/kg,其他5种样品均未检出5种药物。

对胶囊D的一级质谱图进行分析,可以提取出质荷比(m/z)为330.168 8 的化合物,且该化合物的保留时间为 2.176 min(图5),与青藤碱标准溶液的一级质谱图吻合,可以基本确定胶囊D中添加了青藤碱。

图5 胶囊D的青藤碱质谱图

为了进一步确证该样品中含有非法添加物青藤碱,对样品的二级质谱图进行分析见图6。由图6可知,响应强度较高的2个碎片离子分别为 181.069 7和207.044 3,与青藤碱的定性离子对181.064 5和207.043 8 吻合,且质荷比在偏差范围内,因此,可以确定胶囊D中330.168 8 的色谱峰为青藤碱。

图6 胶囊D的二级质谱图

3 结论

本试验建立了一种同时检测安神类保健食品中青藤碱、罗通定、扎来普隆、文拉法辛、褪黑素5种非法添加物的方法。该法分析速度快、灵敏度高、选择性强、精密度高,定性和定量一次完成,回收率和精密度均能满足国家标准的要求,可用于保健品中安神类非法添加物的检测。但本试验仅研究了5种化合物,后续宜扩大这类非法添加物的种类,使中国保健品食品检测技术更加成熟,适用性更广。

猜你喜欢

添加物青藤响应值
外源添加物对自制生物有机肥保存期的影响
基于荧光光谱技术的不同食用淀粉的快速区分
气相色谱法测定蔬菜中常见有机磷农药响应值变化规律
硅基添加物对铁沟浇注料性能的影响
猫须草的组织培养及添加物研究
提高环境监测数据准确性初探
紫外荧光法测硫各气路流量对响应值的影响
青藤碱磷脂复合物的制备、表征及体外透皮研究
三叶青藤正丁醇部位化学成分的研究
保健食品非法添加物检测技术探讨