应用菌刺洗脱法高效分离猴头菇单孢

龚文兵 谢纯良 周映君 朱作华 王亚惠 彭源德

（中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205）

猴头菇[Hericium erinaceus(Bull.) Pers]，是一种极为重要的食药用菌，因外形酷似猴头而得名。猴头菇进入人们的饮食由来已久，《临海水土异物志》中称：“民皆好啖猴头羹，虽五肉臛不能及之。”猴头菇栽培起源于中国，是我国目前常规栽培的食药用菌之一[1]。

自1994年Kawagishi等[2]从猴头菇菌丝体中发现一类鸟巢烷型二萜类化合物（猴头菌素），并报道该类化合物具有促进神经生长因子合成活性以来，猴头菇中的二萜类化合物受到了广泛的关注。目前已经从猴头菇中分离到 25种鸟巢烷型二萜类化合物[3-4]。此外，猴头菇中还含有其他类型的活性成分，包括多糖、甾体化合物、生物碱类化合物等，具有保肝护胃、抗癌、抗氧化等多种功效[4]。多年来围绕猴头菇的研究报道主要集中于活性物质的提取与鉴定[5]，而对其遗传育种的研究严重滞后，导致新品种选育进程缓慢，严重影响了猴头菇产业的健康发展。

优良的菌种是食药用菌产业可持续发展的基础，杂交育种是食药用菌品种选育中应用最广泛、成效最显著的育种方法之一[6]。猴头菇是异宗结合担子菌，减数分裂后产生有性担孢子[7-8]。可以利用单孢菌株配对进行猴头菇杂交育种，获得性状优良的新品种。杂交育种中最关键的环节是通过单孢分离获得单核体。与香菇等伞菌一样，在猴头菇中通常采用子实体悬挂法分离单孢[7,9]。其方法是将整个子实体置于无菌的孢子收集器中弹射孢子1天左右，制备孢子悬浮液，连续稀释后接种于培养基，再获得单孢菌株。由于猴头菇子实体表面不光滑，担孢子着生于裸露的菌刺上，采用子实体悬挂法分离单孢污染率较高，并且操作时间长。本试验建立一种简单快速的单孢分离方法，旨在推动猴头菇的遗传育种研究。

1 试验材料

1.1 供试菌株

供试菌株为猴头菇杂交子HeC9，由‘常山猴头菇’和‘猴头911’的单核体菌株配对获得。‘常山猴头’和‘猴头 911’菌株由四川省农业科学院土壤肥料研究所王波老师提供。

1.2 供试培养基

MEA培养基：麦芽浸粉 30.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，琼脂15.0 g，水1 000 mL。

100 mg/mL氨苄青霉素配置：称取5 g氨苄青霉素置于50 mL 离心管中，加入40 mL无菌水，充分混匀后定容至50 mL。采用0.22 μm 滤膜过滤，灭菌，分装后置于-20 ℃下保存备用。

2 试验方法

2.1 孢子采集

参照于海龙等[10]的方法进行猴头菇栽培，子实体八成熟时采收。在超净工作台上，用75%的酒精对猴头菇子实体进行消毒。分两种方法收集单孢，一为子实体悬挂弹射法。选择9个猴头菇子实体进行单孢分离，用灭菌的500 mL 烧杯作为孢子收集器收集单孢，孢子弹射时间为24 h。另一为菌刺洗脱法。将2 μL 100 mg/mL氨苄青霉素加入含有2 mL无菌水的离心管中，用无菌的镊子挑取1个猴头菇子实体上的9根菌刺，放入上述氨苄青霉素溶液中清洗数次，再将清洗后的菌刺放入含有2 mL 无菌水的离心管中摇晃数次，即制成猴头菇孢子悬浮液（菌刺洗脱法）。每根菌刺制备1管孢子悬浮液。

2.2 单孢分离

采用连续稀释法进行猴头菇孢子的分离。通过连续稀释孢子液，使孢子分散到较低浓度，再取200 μL稀释后的猴头菇孢子悬浮液，用玻棒均匀涂布于含有氨苄青霉素的MEA培养基中（20 mL培养基中加入20 μL 100 mg/mL氨苄青霉素），然后将培养皿置于恒温箱内，25 ℃避光培养。

2.3 单核菌丝鉴定

待孢子萌发至肉眼可见，即刻挑取单菌落，置于新培养基中继续培养。待培养皿中的菌落长到1～2 cm时，置于显微镜下观察，没有锁状联合即是由担孢子萌发而生成的单核菌丝。

采用子实体悬挂弹射法分离单孢作为对照，选取整个猴头菇子实体制备孢子悬浮液，再用无菌水连续稀释进行单孢分离[9]。

3 结果与分析

3.1 两种单孢分离方法的比较

试验结果表明，子实体悬挂弹射法中，2个子实体在孢子收集器中感染真菌，弃用；4个子实体获得了孢子悬浮液，经连续稀释后涂布于MEA培养基，所有的平皿全部感染细菌；仅有3个猴头菇子实体获得了单菌落，成功率为33.3%。在菌刺洗脱法中，随机选择1个猴头菇子实体上的9根菌刺制备了9组孢子悬浮液，经过稀释、涂平皿后，有1组孢子悬浮液平皿感染细菌，其余8组获得了单菌落，成功率为88.9%。

单孢分离能否成功，与操作难易程度、操作者的分离技术等相关。新鲜猴头菇从开放的环境中采收，子实体上的杂菌较多，尤其是细菌。子实体悬挂弹射法中，虽然用75%的酒精对猴头菇子实体进行了消毒，但由于子实体较大，表面不光滑，菌刺较多，难以消毒彻底。而菌刺洗脱法只需对挑取的单根菌刺进行抑菌消毒处理，消毒效果要好得多，这是菌刺洗脱法能够显著降低污染率的主要原因。此外，与子实体悬挂弹射法比较，菌刺洗脱法无需专门的孢子收集器，直接用无菌水将猴头菇菌刺上的孢子洗下来，操作简单，也不用等待孢子弹射，缩短了单孢分离的时间。

3.2 稀释浓度对挑取单菌落的影响

获得孢子悬浮液后，采用连续稀释法进行猴头菇孢子的分离。菌刺洗脱法中，稀释了3个浓度梯度（10-1、10-2、10-3）。在子实体悬挂弹射法中，稀释了 6 个浓度梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6）。每种浓度孢子悬浮液涂布5个含有MEA培养基的平皿。涂皿结果（表 1）表明，菌刺洗脱法中，10-1浓度的孢子悬浮液所涂平皿，萌发的单菌落很密集，单个平皿中的单菌落数大于等于100个，难以挑取单菌落到新的培养基上。10-2浓度的孢子悬浮液，孢子萌发的单菌落数量比较适中，单个平皿的单菌落数多介于 10～50个之间，易于挑取单菌落。10-3浓度的孢子悬浮液所涂平皿单菌落偏少，单个平皿单菌落不足10个。子实体悬挂弹射法中，4个稀释浓度（10-1、10-2、10-3、10-4）的孢子悬浮液所涂平皿上单菌落密集，难以挑取单菌落。10-5浓度的孢子悬浮液所涂平皿，孢子萌发的单菌落数量比较适中。10-6浓度的孢子悬浮液所涂的平皿上单菌落较少（表1）。这可能是由于猴头菇单根菌刺上的孢子数量远远低于其整个子实体上的孢子数量。孢子悬浮液的稀释倍数影响后续挑取单菌落的难易程度。可以在涂皿前，取孢子悬浮液进行镜检，视野中有3～5个孢子的悬浮液浓度较适宜。

表1 稀释浓度与单菌落数量的关系

3.3 单核菌丝镜检结果

利用菌刺洗脱法，总共获得了240个单菌落。对这些萌发的菌株进行显微镜观察鉴定，若无锁状联合的可初步认为是单孢萌发而生成的单核菌丝，有锁状联合的为双核菌丝。结果显示，单核菌丝较双核菌丝细，挑取的240个菌株中，222个是单核菌株（图1），其余18个菌株是具有锁状联合的双核菌株（图2），采用菌刺洗脱法分离获得的单核菌株比例为92.5%。萌发的双核菌丝可能是由于挑取的菌落中包含了可以配对的单孢。

图1 猴头菇单核菌丝

图2 猴头菇双核菌丝

4 结 论

由于猴头菇子实体表面布满菌刺，而担孢子着生于裸露的菌刺上，采用传统的子实体悬挂法分离单孢成功率不高。本研究建立了一种简单易行的猴头菇单孢分离方法，对推动猴头菇遗传育种研究具有积极意义。与子实体悬挂弹射法相比，最大的不同在于本方法是利用易于消毒的猴头菇菌刺，将菌刺上的单孢直接洗下来，非常简单、方便，不需专门的孢子收集器。在降低污染率的同时，也缩短了单孢分离的时间，是一种切实可行的单孢分离手段。除了猴头菇，本方法还可以推广到其他食药用菌品种，挑取小块着生孢子的组织进行消毒抑菌处理，将孢子冲洗下来后再分离单孢，尤其适合子实体表面不光滑，难以进行消毒的菇类。