红铃虫性信息素合成激活肽基因克隆、序列特征及在不同发育阶段的表达分析

许冬，王玲，丛胜波，王金涛，李文静，万鹏



红铃虫性信息素合成激活肽基因克隆、序列特征及在不同发育阶段的表达分析

许冬，王玲，丛胜波，王金涛，李文静，万鹏

（湖北省农业科学院植保土肥研究所/农业部华中作物有害生物综合治理重点实验室/农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室，武汉 430064）

【目的】克隆红铃虫（）性信息素合成激活肽（pheromone biosynthesis activating neuropeptide，PBAN）基因，分析其序列特征，阐明该基因在红铃虫不同发育阶段中的表达规律，以及与交配行为、棉花挥发物间的调控关系，为进一步揭示红铃虫性信息素合成释放机制提供科学依据。【方法】利用RACE技术克隆红铃虫性信息素合成激活肽基因的全长cDNA序列，应用DNAMAN 6.0对其进行序列分析，利用Protparam、Chou & Fasman等在线分析软件进行蛋白二级结构预测和生物信息学分析；利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测在红铃虫不同发育阶段的表达规律，分析交配行为和棉花挥发物对表达水平的影响。【结果】获得了全长cDNA序列，Genbank登录号为KY987647，该基因cDNA全长1 461 bp，其开放阅读框（ORF）为618 bp，编码205个氨基酸，5′端非编码区长121 bp，3′端非编码区长722 bp；编码的氨基酸序列包含了滞育激素、神经肽、神经肽、PBAN和神经肽5种神经肽，N端还含有一个23氨基酸的信号肽；预测该蛋白分子量为2.41 kD，等电点为9.25；同源性及系统进化树分析发现，PgosPBAN与15种鳞翅目昆虫的PBAN位于同一分支，其中与PgosPBAN进化关系最近的是二化螟（）的PBAN（GenBank登录号：ALM30314.1），表明这两个基因可能有共同的祖先基因；在红铃虫不同发育阶段存在明显的表达特异性，以成虫期的表达量较高，幼虫期次之，蛹期最低；在红铃虫雌、雄成虫体内均有表达，且1—5 d内雄性成虫表达量显著高于雌性成虫；交配后1—3 d的红铃虫体内表达水平显著高于处女蛾；暴露于棉花挥发物1—5 d雄成虫表达水平未受到显著影响，而1、8 d雌成虫及8 d雄成虫表达水平均显著低于对照。【结论】明确了的核苷酸、氨基酸序列特征，分析了该蛋白的二级结构特征。根据在红铃虫不同发育阶段的表达规律以及与交配行为、棉花挥发物的调控关系，推测该基因不仅参与了红铃虫雌性信息素的合成释放，在调控雄性信息素以及调节生长发育等方面可能也扮演着重要角色。

红铃虫；性信息素合成激活肽；表达分析；交配行为；棉花挥发物

0 引言

【研究意义】红铃虫（）是一种世界性的重要棉花害虫，以幼虫钻入棉花的蕾、花、铃等繁殖器官进行危害。因其在组织外滞留时间短，导致各种传统防治方法效果有限，给棉花的生长造成严重损失。20世纪70年代末，美国成功研发出红铃虫性信息素，并在生产应用中取得良好效果[1]。我国也是较早利用红铃虫性信息素开展虫情监测和害虫防治的国家[2]。目前，各国在红铃虫性信息素化学结构、组分比例、田间应用等方面作了大量研究[3]，但有关红铃虫性信息素在虫体内的合成、释放及作用的分子机制尚缺乏深入了解。蛾类昆虫性信息素合成与释放受其体内性信息素合成激活肽（pheromone biosynthesis activating neuropeptide，PBAN）控制。该活性肽是一种C端具有FXPRL五肽序列的昆虫神经肽，除了与昆虫性信息素合成释放相关外，还在表皮色素控制、胚胎滞育以及刺激内脏肌肉收缩等生理过程中发挥着重要作用[4-5]。因此，研究PBAN在红铃虫生长发育、求偶交配及与寄主化学通讯过程中的表达规律，以揭示红铃虫性信息素合成释放的调控机制，可为进一步探讨棉花害虫遗传防治的新途径，如设计具有激活或抑制作用的类似物，研制高效、专一性强、无公害的性信息素提供思路[6]。【前人研究进展】大多数蛾类昆虫的性信息素释放具有明显的昼夜节律性，而昆虫性信息素合成激活神经肽PBAN是控制其合成和释放的最主要调控因子[7]。PBAN最初从谷实夜蛾（）中分离得到，后陆续又在棉铃虫（）[8]、烟草天蛾（）[9]、家蚕（）[10]、水稻二化螟（）[11]、小菜蛾（）[12]、分月扇舟蛾（）[13]等多种鳞翅目昆虫中以及双翅目昆虫埃及伊蚊（）[14]中克隆鉴定。PBAN主要是通过影响合成途径中不同的关键酶，最终导致这些反应的不同组合产生各种昆虫所特有的信息素混合物。Tsfadia等[15]研究了印度谷螟（）和棉铃虫的酶抑制剂对性信息素的生物合成途径及限制速率，证实PBAN可对性腺分泌的乙酰辅酶A产生影响，并通过刺激脂肪酸合成酶系中的乙酰辅酶A羧化酶来增加其活性，进而促使性信息素合成[7,15]。但目前的研究显示，不同物种中PBAN的调控机制有所不同，如玉米螟PBAN可通过增加脂肪酸生物合成时的底物来调控信息素生物合成，而家蚕体内PBAN的作用却是减少脂肪酸生物合成时的底物供应[16-17]。值得注意的是，PBAN对蛾类性信息素的调节不仅仅局限在雌虫中，随后的研究表明PBAN在雄性个体中也有表达，并且在雄性信息素产生中起着关键作用[18]。研究进一步发现，PBAN并不是调控性信息素合成的唯一物质，在一些昆虫中，保幼激素（juvenile hormone，JH）和章鱼胺（octopamine，OA）对调控性信息素也起着一些作用[19-20]。RafAeli等学者认为保幼激素可通过控制PBAN的释放进而控制信息素的生物合成，并且能够控制PBAN等进入血淋巴，进而调控其体色多态现象[21]。RafAeli等在细胞水平揭示章鱼胺在刺激产生性信息素的过程中起到中间传递信息的作用，它能与PBAN相互作用抑制性信息素生物合成[22]。研究还发现，大多鳞翅目害虫PBAN的转录前体除了编码PBAN外，还可编码-神经肽、-神经肽、滞育激素（diapause hormone，DH）以及-神经肽等[23]。如PBAN编码的滞育激素在有的昆虫蛹滞育期可作用于卵巢诱导其胚胎滞育，而在另外一些昆虫体内却能缩短滞育时期甚至打破滞育[24]，甚至有些昆虫PBAN的多肽序列还包含了黑化作用和红化作用激素，可在幼虫阶段对表皮起黑化作用，成虫发育过程调节信息素生物合成[25]。【本研究切入点】红铃虫性信息素已被应用于棉花害虫绿色防控，但红铃虫本身性信息素合成释放的机制尚不清楚。【拟解决的关键问题】明确红铃虫PBAN基因（）序列特征及其在不同发育阶段的表达规律，探索昆虫交配行为及棉花挥发物对表达水平的影响，为阐明红铃虫性信息素合成、释放机制打下基础。

1 材料与方法

试验于2016年5月至2018年6月在湖北省农业科学院植保土肥研究所完成。

1.1 试验材料

红铃虫为敏感品系，于2003年采自湖北省潜江地区（N 30°20′55.63″、E 112°55′58.41″）棉田，经笔者实验室人工饲料连续饲养，期间不接触任何农药。供试红铃虫幼虫在（27±1）℃、相对湿度50%左右的养虫间饲养，自然光照。待其化蛹后，将其置于光照培养箱中，温度（27±1）℃，相对湿度70%左右，光周期L﹕D=14 h﹕10 h。

鄂棉24为常规棉，由湖北省农业科学院植保土肥研究所棉花病虫害课题组提供。于2016年5月上旬种植于湖北省农业科学院试验田中，N 30°28′53.33″、E114°18′40.24″。

1.2 PgosPBAN全长cDNA克隆

1.2.1cDNA片段序列扩增 红铃虫总RNA提取采用TRIzol法，提取试剂盒购自Invitrogen。反转录参考Promega公司的Reverse Transcription System试剂盒说明书进行。利用DNAMAN Version 6软件，分析已经报道的鳞翅目害虫PBAN的氨基酸序列，根据保守区结合密码子偏好特性，利用Primer 5.0设计兼并引物-F、-R（表1），以合成的cDNA第一链为模板进行PCR。反应体系：10× LA taq buffer 2.5 μL，dNTPMix（2.5 mmol·L-1each）2 μL，LA taq 0.25 μL，正反引物各1.25 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 15.75 μL。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，32个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带用Gel Extraction Kit凝胶回收试剂盒回收纯化。后连接到T-easy克隆载体，转化到Dh5感受态细胞，涂布到含有氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基。37℃培育过夜，经蓝白斑筛选，挑取白色单菌落放入含有Amp的LB液体培养基中，37℃，200 r/min培养12 h。经菌液PCR验证，将目的条带大小合适的菌液采用质粒提取试剂盒（AXYGEN）提取质粒，并送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序验证。

1.2.23′和5′-末端cDNA序列扩增 设计目的基因序列片段外侧和内侧特异性引物，采用TaKaRa RACE试剂盒扩增该基因3′和5′-末端cDNA序列。扩增产物处理方法同上，测序得到目的基因3′和5′-末端cDNA序列片段，用DNAMAN软件拼接得到目的基因全长cDNA序列，最后再根据所拼接序列设计引物进行扩增全长的PCR验证。

1.3 PgosPBAN序列分析、进化树构建和蛋白二级结构预测

采用生物信息学在线工具Protparam（https://web. expasy.org/protparam/）预测蛋白理论分子量、等电点、亲脂性；利用SignaIP 4.1 Serve（http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）预测信号肽；蛋白二级结构利用Chou & Fasman二级结构服务器进行预测；跨膜预测分析（http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/，TMHMM）；利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的BLASTx程序搜索序列同源相似性；采用DANMAN V6软件比对蛋白序列的同源相似性；采用MEGA7.0软件构建蛋白的系统发育进化树，用邻接法（neighbor-joining，NJ）并经bootstrap重复1 000次抽样分析。

1.4 PgosPBAN在红铃虫不同发育阶段的表达

分别选取5日龄幼虫12头、10日龄（4龄幼虫）幼虫5头、1日龄和5日龄蛹各5头，以及羽化0 d（羽化当天）、1、3、5、8 d的雌、雄成虫各5头用于表达量测定，采用双标准曲线法[26]。荧光定量PCR（qRT-PCR）反应体系：SYBR® Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（2X）10 μl，上、下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，无RNA酶水7 l。采用两步法PCR标准法，扩增程序：95℃2 min；95℃5 s，60℃30 s，共40个循环。以红铃虫的为内参基因，采用Primer 5.0软件分别设计目的基因和内参基因引物（表1）。将含有目的基因和内参基因的质粒标准品与不同发育阶段的红铃虫样品，在同一96孔板上进行qRT-PCR反应并制作标准曲线。每处理设5个生物学重复及3个技术重复，以无菌水为对照。根据目的和内参基因质粒标准品构建的标准曲线获取基因的拷贝数含量，通过内参基因的均一化处理计算红铃虫各处理中目的基因相对于内参基因的表达量。同时，以羽化当天（0 d）雌虫表达量为标准定量，计算红铃虫不同发育阶段基因相对表达量。

表1 PgosPBAN扩增所用引物

1.5 交配行为对PgosPBAN表达的影响

选取刚羽化的红铃虫处女蛾，按性比1﹕1的比例，将红铃虫雌、雄成虫放置于塑料产卵罐中（直径10 cm，高15 cm），产卵罐顶端用50目的纱网覆盖，底端密封，内置10%的蜂蜜水和供红铃虫成虫休息、隐藏的折叠纸片。在首个暗期处理8 h时，用微红光源每隔0.5 h观察一次交配情况。选取有交配行为的成虫作为试验用虫。在首次交配后第1个和第3个暗期3 h左右，取红铃虫雌、雄成虫各5头，用于测定红铃虫雌、雄成虫体内表达量，重复4次。基因表达量测定方法同1.4。

1.6 棉花挥发物对PgosPBAN表达的影响

选取刚羽化的红铃虫处女雌、雄蛾，分别放置于不同的产卵罐后，将其置于四周放置有棉苗（5—7叶期）的封闭塑料盒中（40 cm×50 cm）饲养，以不放棉苗处理作为对照。设置处理时间为1、3、5、8 d。每重复取5头成虫，重复4次。待各处理时间到达后，将处理的雌、雄成虫取出，用于测定表达 量。测定方法同1.4。

1.7 数据统计与分析

利用SPSS 16.0统计软件对红铃虫不同发育阶段内表达量进行方差分析，采用One-way ANOVA用于显著性检验，多重比较采用Duncan’s新复极差法分析（＜0.05）。

2 结果

2.1 PgosPBAN全长cDNA克隆及序列分析

通过RACE技术扩增获得cDNA全长序列（Genbank登录号：KY987647）。该序列全长1 461 bp，其中开放阅读框（ORF）618 bp，编码205个氨基酸。5′端的非翻译区（5′-UTR：untranslated regions）长121 bp，3′-UTR长722 bp。根据基因拼接结果的序列设计特异性引物，以红铃虫幼虫和成虫混合的cDNA为模板进行扩增，可以克隆到ORF区的cDNA全长序列（图1），且电泳条带与预测片段大小一致。

M：DL2000 DNA marker；1：PgosPBAN ORF区PCR产物PCR products of the coding sequence of PgosPBAN

以SignalP 4.0推导出蛋白序列后，发现其N端有一条潜在的信号肽：M1-A23，紧随后面的是DH类似肽（S24-W54）。同时，全长序列中含有6个典型的识别切割位点，分别为G55-K56-R57、K102-K103、G111-R112、G135-R136-R137、G171-P172和G181- R182。根据基因的剪切位点，找到了该基因编码的5个神经肽，分别为滞育激素、-食下神经节（-SGNP，V104-L110）、-食下神经节（-SGNP，S113-L134）、PBAN（L138-L170）以及-食下神经节（-SGNP，N173-L180）。每个神经肽的C末端都有FXPR/KL序列。

利用生物信息学在线工具Protparam分析氨基酸序列，该蛋白的预测分子量为2.41 kD；等电点为9.25；含酸性氨基酸（Asp+Glu）31个，占15.2%，碱性氨基酸（Arg+Lys）36个，占17.6%；分子式为C1073H1670N308O314S5；不稳定系数为46.84；脂肪指数为69.46，总平均疏水指数为-0.773。TMHMM显示，该蛋白为非跨膜蛋白，蛋白二级结构组成为13.2%的H（-helix）、10.2%的E（-sheet）、76.6%的C（loop或coil）。

2.2 PgosPBAN氨基酸序列系统进化树构建

采用MEGA 7.0的邻接法对4个目16科23种昆虫PBAN构建了进化树（图2）。结果表明，PgosPBAN与15种鳞翅目昆虫的PBAN位于同一分支。其中与PgosPBAN进化关系最近的是二化螟的PBAN（GenBank登录号：ALM30314.1），表明这两个基因可能有共同的祖先基因；其次是甜菜夜蛾（，GenBank登录号：AAT64424.1）、斜纹夜蛾（，GenBank登录号：AJT60314.1）等其他科14种鳞翅目害虫，表明PgosPBAN与大多鳞翅目昆虫PBAN的亲缘关系较近。PgosPBAN与鞘翅目的光肩星天牛（，GenBank登录号：XP_018561338.1）、赤拟谷盗（，GenBank登录号：XP_015835244.1）以及双翅目媒斑蚊（，GenBank登录号：JAV30566.1）、膜翅目阿里山潜蝇茧蜂（，GenBank登录号：XP_011298848.1）的PBAN位于不同分支上，其亲缘关系较远。

2.3 PgosPBAN在不同发育阶段的表达水平

采用qRT-PCR方法，以羽化当天的处女雌蛾的表达量为基准，分析了红铃虫不同发育阶段表达水平。结果表明，在红铃虫不同发育阶段存在表达特异性，其中在成虫期的表达量较高。羽化1 d的处女雌、雄成虫，相对表达量分别为标准参量的4.3和10.0倍，羽化8 d则分别为11.7和13.8倍。可见，在红铃虫雌、雄成虫体内均有表达，且雄性成虫1—5 d的相对表达量显著高于雌成虫。在幼虫期表达量相对较低，其中，5 d的幼虫比10 d的相对表达量高，分别为6.9和2.3倍。在蛹期相对表达量最低，5 d雌、雄蛹的相对表达量仅为0.06和0.20倍（图3）。

图2 PBAN蛋白系统进化分析

图3 PgosPBAN在红铃虫不同发育阶段的相对表达量

2.4 交配行为对不同发育阶段PgosPBAN表达的影响

通过比较红铃虫成虫在交配前后表达水平，发现有交配行为的红铃虫雌、雄成虫在交配后1 d（首次交配后13 h）和交配后3 d时的表达量都高于未交配处理。其中，在首次交配后13 h，雌、雄成虫体内的相对表达量分别是标准参量的8.9和22.0倍，而未交配的处女雌、雄成虫体则仅为4.3和10.0倍，显著低于交配处理（图4）。

图4 交配行为对红铃虫成虫PgosPBAN表达量的影响

2.5 棉花挥发物对红铃虫成虫PgosPBAN的影响

通过分析棉花挥发物对红铃虫表达水平的影响发现，1—5 d雄成虫表达水平未受到棉花寄主挥发物显著影响，而棉花挥发物处理后1、8 d雌成虫及8 d雄成虫表达水平均显著低于对照处理（图5）。

图5 棉花挥发物对红铃虫成虫PgosPBAN表达量的影响

3 讨论

大多数昆虫编码的5个神经肽都非常保守，而大部分氨基酸残基存在较大的变异多样性[27]，这为遗传改造、干扰成虫交配以及开发高选择性或广谱性的PBAN类似物用于绿色防控开拓了思路[28]。本研究鉴定了，其cDNA全长序列包含6个识别切割位点，编码5个神经肽，且C末端都含有FXPR/KL序列，具有典型的PBAN结构。同源性及系统进化树结果显示，PgosPBAN与大多鳞翅目昆虫的PBAN位于同一个分支，其中与PgosPBAN进化关系最近的是二化螟PBAN，表明这两个基因可能有共同的祖先基因。

在红铃虫不同发育阶段中存在明显的表达特异性。其中，成虫期的相对表达量最高，幼虫期次之，蛹期最低。这与甜菜夜蛾、斜纹夜蛾等昆虫的发育表达模式相似[29-30]，与烟草天蛾等昆虫的发育表达模式则完全不同[9]。PBAN在红铃虫幼虫期和蛹期可能仅行使了部分功能。有研究显示，PBAN编码的滞育激素在部分昆虫的幼虫期可行使推迟若虫进入成熟期的时间、促使若虫群体发育整齐及调节若虫体色变化等功能[30]，在蛹期则可能存在刺激蛹发育和解除滞育的功能[31]。成虫期，表达量表现出随着日龄增大逐渐升高的趋势，暗示其在此时期可能已开启性信息素的合成功能，为分泌大量性信息素合成其相关前体物质[32]。此结果与红铃虫羽化前期具有旺盛的交配能力相吻合。虽然本试验只能在mRNA水平而不是在蛋白水平直接证明在红铃虫成虫1—8 d内呈上升趋势，但结合红铃虫求偶行为的研究结果（未发表），处女蛾在羽化前期（1—13 d）的暗期求偶持续时间也随日龄的增加而上升，表明其求偶行为与表达量有密切的联系，这在一些昆虫中已有详细的研究[33-34]。另外，本研究还发现，与美洲棉铃虫[18]等昆虫相似，表达不局限于红铃虫雌虫，其雄虫体内也有较高水平表达，且表达量高于雌虫，说明在红铃虫雄性性信息素合成释放以及生长发育等生理过程可能也发挥着重要作用。有研究显示，大多数昆虫雄蛾性信息素主要是近距离激发雌虫性欲，抑制同种其他雄虫前来交配[35-36]。本试验将多头雌、雄成虫置于同一容器中，雄蛾个体间为了趋避同种、避免交配竞争势必会刺激合成PBAN，从而产生更多的性信息素来吸引雌性。PBAN与雄性信息素间的关系有待于进一步研究。

交配行为是影响性信息素以及PBAN合成释放的一个重要因素。有研究显示，大多数昆虫交配后，其体内PBAN短期内会先受到显著抑制后又逐渐恢复[30,37-38]。但有的昆虫交配后，性信息素合成释放短时间内虽会受到抑制，但体内性腺的活性以及PBAN在食下神经节内的合成并不受影响[39]。说明交配行为对不同昆虫PBAN合成释放的调控影响差异较大。本研究结果显示，红铃虫雌、雄成虫在交配处理后1 d和3 d，其体内相对表达量均显著高于处女蛾，证实交配行为对1—3 d红铃虫成虫的调控作用显著。鉴于相对表达量与性信息素含量变化往往呈反比[18]，笔者推测红铃虫处女蛾为了交配成功，可能会加大合成释放性信息素，从而导致其体内前体物质PBAN的大量损耗，而有交配行为的红铃虫，对再次交配的投入会相应减少，其体内合成释放PBAN的速率也会受到抑制。

另外，本研究还发现棉花挥发物对存在一定的调控作用。暴露于棉花挥发物1—5 d雄成虫表达水平未受到显著影响，而1、8 d雌成虫及8 d雄成虫表达水平均显著低于对照。这与植物挥发物对小菜蛾的调控机制相似。有研究显示，暴露于植物挥发物异硫氰酸丙烯酯的小菜蛾在羽化后18 h和60 h时表达量均显著低于对照处理[40]。说明寄主植物挥发物对昆虫PBAN合成及性信息素释放存在一定的调控及刺激作用。对于红铃虫羽化后期成虫，棉花挥发物可能会激发其对性信息素的积极行为，通过这种增效及补偿机制以达到成功交配，但势必会导致红铃虫体内大量前体物质的损耗。

4 结论

利用RACE技术分离得到全长序列1 461 bp，ORF为618 bp，编码205个氨基酸，且N端有一条潜在的信号肽。该基因含有6个保守的识别切割位点，编码5个神经肽，每个神经肽的C末端都有FXPR/KL序列，其编码的蛋白与大多鳞翅目昆虫具有高度同源性。在红铃虫不同发育阶段存在明显的表达特异性。表达不局限于红铃虫雌蛾，雄性个体也有大量表达，且表达量高于雌蛾。根据在红铃虫不同发育阶段的表达规律以及与交配行为、棉花挥发物的调控关系，推测该基因不仅参与了红铃虫雌性信息素的合成释放，在调控雄性信息素以及调节生长发育等方面可能也扮演着重要角色。

[1] 束春娥, 曹赤阳, 柏立新, 曹雁平, 孙洪武, 张永孝. 棉红铃虫性信息素应用技术研究. 华东昆虫学报, 1995, 4(2): 106-112.

SHU C E, CAO C Y, BAI L X, CAO Y P, SUN H W, ZHANG Y X. Studies on applying gossyplure in controlling pink bollworm (Saunders) on cotton., 1995, 4(2): 106-112. (in Chinese)

[2] 段敏. 性信息素在棉红铃虫防治中的应用. 中山大学研究生学刊自然科学版, 1995, 16(2): 72-78.

DUAN M. Sex pheromone for the control of(Lepidoptera: Gelechiidae)., 1995, 16(2): 72-78. (in Chinese)

[3] COLLINS R D, CARDE R T.Heritable variation in pheromone response of the pink bollworm,(Lepidoptera: Gelechiidae)., 1989, 15(12): 2647-2659.

[4] NÄSSEL D R. Neuropeptides in the nervous system ofand other insects: multiple roles as neuromodulators and neurohormones//. Elsevier Science Ltd., 2002, 68: 1-84.

[5] 鲁玉杰, 郭云峰. PBAN/pyrokinin神经肽类及其基因的研究进展. 生物技术通报, 2008(增刊): 53-58.

LU Y J, GUO Y F. Research advance in PBAN/pyrokinin neuropeptideand its gene., 2008(Suppl.): 53-58. (in Chinese)

[6] 杨惠, 张金桐. 德国小蠊聚集信息素的组分及含量测定. 寄生虫与医学昆虫学报,2004, 11(1): 42-46.

YANG H, ZHANG J T. Measurement of the compositions and contents of the aggregation pheromone from German cockroach,., 2004, 11(1): 42-46. (in Chinese)

[7] RAFAELI A. Pheromone biosynthesis activating neuropeptide (PBAN): regulatory role and mode of action., 2009, 162(1): 69-78.

[8] ZHANG T Y, SUN J S, ZHANG L B, SHEN J L, XU W H. Cloning and expression of the cDNA encoding the FXPRL family of peptides and a functional analysis of their effect on breaking pupal diapause in., 2004, 50(1): 25-33.

[9] Xu W H, Denlinger D L. Identification of a cDNA encoding DH, PBAN and other FXPRL neuropeptides from the tobacco hornworm,, and expression associated with pupal diapause., 2004, 25(7): 1099-1106.

[10] 徐春媛, 刘彦群, 鲁成, 向仲怀. 中国野桑蚕性信息素合成激活肽()基因的克隆及序列分析. 遗传学报, 2003, 30(11): 1034-1040.

XU C Y, LIU Y Q, LU C, XIANG Z H. Molecular cloning and sequence analysis of pheromone biosynthesis activating neuropeptide () gene ofChina., 2003, 30(11): 1034-1040. (in Chinese)

[11] 常菊花, 何月平. 水稻螟虫神经肽PBAN及其受体序列的生物信息学分析. 应用昆虫学报, 2016, 53(3): 456-462.

CHANG J H, HE Y P. Bioinformatic analysis of PBAN and its receptor proteins in rice stem borers., 2016, 53(3): 456-462. (in Chinese)

[12] LEE D W, BOO K S. Molecular characterization of pheromone biosynthesis activating neuropeptide from the diamondback moth(L.)., 2005, 26(12): 2404-2411.

[13] JING T Z, WANG Z Y, QI F H, LIU K Y. Molecular characterization of diapause hormone and pheromone biosynthesis activating neuropeptide from the black-back prominent moth,(L.) (Lepidoptera: Notodontidae)., 2007, 37(12): 1262-1271.

[14] CHOI M Y, ESTEP A, SANSCRAINATE N, BECNEL J, VANDER MEER R K. Identification and expression of PBAN/diapause hormone and GPCRs from.,2013, 375(1/2): 113-120.

[15] TSFADIA O, AZRIELLI A, FALACH L, ZADA A, ROELOFS W, RAFAELI A. Pheromone biosynthetic pathways: PBAN-regulated rate-limiting steps and differential expression of desaturase genes in moth species., 2008, 38(5): 552-567.

[16] TANG J D, CHARLTON R E, JURENKA R A, WOLF W A, PHELAN P L, SRENG L, ROELOFS W L. Regulation of pheromone biosynthesis by a brain hormone in two moth species, 1989, 86(6): 1806-1810.

[17] OZAWA R A, ANDO T, NAGASAWA H, KATAOKA H, SUZUKI A. Reduction of the acyl group: the critical step in bombykol biosynthesis that is regulatedby the neuropeptide hormone in the pheromone gland of., 1993, 57(12): 2144-2147.

[18] JURENKA R, RAFAELI A. Regulatory role of PBAN in sex pheromone biosynthesis of heliothine moths., 2011, 2: Article 46.

[19] CHOI M Y, JURENKA R A. PBAN stimulation of pheromone biosynthesis by inducing calcium influx in pheromone glands of., 2004, 50: 555-560.

[20] 穆兰芳, 董双林, 刘慕兰, 邢光南. 铃夜蛾属昆虫性信息素生物合成及内分泌调控. 昆虫知识, 2005, 42(2): 128-131.

MU L F, DONG S L, LIU M L, XING G N. The endocrine regulation and biosynthesis of sex pheromones in some species of., 2005, 42(2): 128-131. (in Chinese)

[21] RAFAELI A, ZAKHAROVA T, LAPSKER Z, JURENKA R A. The identification of an age- and female-specific putative PBAN membrane-receptor protein in pheromone glands of: possible up-regulation by juvenile hormone., 2003, 33(3): 371-380.

[22] RAFAELI A, GILEADI C. Down regulation of pheromone biosynthesis: cellular mechanisms of pheromonostatic responses.,1996, 26(8/9): 797-807.

[23] 王姗姗. RNAi介导的甜菜夜蛾性信息素合成激活肽及其受体基因的功能鉴定[D]. 北京: 中国农业科学院, 2015.

WANG S S. Function identification of pheromone biosynthesis- activating neuropeptide and it’s receptor by using RNAi, in(Hübner)[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2015. (in Chinese)

[24] ZHAO J Y, XU W H, KANG L. Functional analysis of the SGNP I in the pupal diapause of the oriental tobacco budworm,(Lepidoptera: Noctuidae)., 2004, 118(1/2): 25-31.

[25] MATSUMOTO S,KITAMURA A, NAGASAWA H, KATAOKA H, ORIKASA C, MITSUI T, SUZUKI A. Functional diversity of a neurohormone produced by the suboesophageal ganglion: molecular identity of melanization and reddish colouration hormone and pheromone biosynthesis activating neuropeptide., 1990, 36(6): 427-432.

[26] 徐丽华, 刘春雷, 常玉梅, 梁利群, 刘金亮, 高国强, 韩启霞. 双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法. 生物技术通报, 2011(1): 70-75.

XU L H, LIU C L, CHANG Y M, LIANG L Q, LIU J L, GAO G Q, HAN Q X. Theory and method of double-standard curves method of relative quantification PCR., 2011(1): 70-75. (in Chinese)

[27] RAINA A K, JAFFE H, KEMPE T G, KEIM P, BLACHER R W, FALES H M, RILEY C T, KLUN J A, RIDGWAY R L, HAYES D K. Identification of a neuropeptide hormone that regulates sex pheromone production in female moths., 1989, 244(4906): 796-798.

[28] NACHMAN R J. Peptidomics applied: A new strategy for development of selective antagonists/agonists of insect pyrokinin (FXPRLamide) family using a novel conformational-mimetic motif., 2014, 3: 138-142.

[29] XU J, SU J Y, SHEN J L, XU W H. Cloning and expression of the gene encoding the diapause hormone and pheromone biosynthesis activating neuropeptide of the beet armyworm,2007, 18(2): 145-151.

[30] 陆沁. 斜纹夜蛾性信息素合成激活肽(PBAN)的基因克隆及功能分析[D]. 昆明: 云南大学, 2015.

LU Q. Identification and functional analysis of the pheromone biosynthesis activating neuropeptide (PBAN) in the common cutworm moth(Lepidoptera: Noctuidae)[D]. Kunming: Yunnan University, 2015. (in Chinese)

[31] ZHANG T Y, SUN J S, ZHANG Q R, XU J, JIANG R J, XU W H. The diapause hormone-pheromone biosynthesis activating neuropeptide gene ofencodes multiple peptides that break, rather than induce, diapause., 2004, 50(6): 547-554.

[32] 李娟. 沙棘木蠹蛾PBAN与JHAMT的分子特征及对性信息素合成调控的研究[D]. 北京: 北京林业大学, 2013.

LI J. Molecular characterization of PBAN and JHAMT and their effect on pheromone biosynthesis from the seabuckthorn carpenterworm,(Lepidoptera: Cossidae)[D]. Beijing: Beijing Forestry University, 2013. (in Chinese)

[33] RAINA A K, KLUN J A, STADELBACHER E A. Diel periodicity and effect of age and mating on female sex pheromone titer in(Lepidoptera: Noctuidae)., 1986, 79(1): 128-131.

[34] RAFAELI A, BOBER R. The effect of the juvenile hormone analog, fenoxycarb on the PBAN-receptor and pheromone production in adults of the moth: an “aging” hormone in adult females?, 2005, 51(4): 401-410.

[35] 宋春满, 李天飞. 烟夜蛾性信息素的研究利用进展. 西南农业大学学报, 2001, 23(2): 153-155.

Song C M, LI T F. Advances in the study and application of sex pheromone of., 2001, 23(2): 153-155. (in Chinese)

[36] 高景林, 赵冬香. 昆虫信息化合物. 热带农业科学, 2005, 25(4): 86-91.

GAO J L, ZHAO D X. Semiochemicals in insect behavior and ecology., 2005, 25(4): 86-91. (in Chinese)

[37] DELISLE J, PICIMBON J F, SIMARD J. Regulation of pheromone inhibition in mated females ofand., 2010, 46(6): 913-921.

[38] NAGALAKSHMI V K, APPLEBAUM S W, AZRIELLI A, RAFAELI A. Female sex pheromone suppression and the fate of sex-peptide-like peptides in mated moths of., 2007, 64(3): 142-155.

[39] AHN S J, MAN Y C, BOO K S. Mating effect on sex pheromone production of the oriental tobacco budworm,., 2002, 5(1): 43-48.

[40] 徐瑞斌. 光周期、营养源和植物挥发物对小菜蛾成虫生物学的影响[D]. 福州: 福建农林大学, 2016.

XU R B. Effects of photoperiod, nutrition and plant volatile on the biological characteristic of adult diamondback moth,[D]Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2016. (in Chinese)

Cloning, Sequence Analysis and Expression of Pheromone Biosynthesis Activating Neuropeptide (PBAN) Gene in Different Development Stages of

XU Dong, WANG Ling, CONG ShengBo, WANG JinTao, LI WenJing, WAN Peng

(Institute of Plant Protection and Soil Science, Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Central China, Ministry of Agriculture/Hubei Key Laboratory of Crop Disease, Insect Pests and Weeds Control, Wuhan 430064)

【Objective】The objective of this study is to clone the pheromone biosynthesis activating neuropeptide (PBAN) gene of pink bollworm (), analyze its sequence characteristics, clarify its expression patterns in different developmental stages as well as correlation with mating behavior and cotton volatiles, which will provide a scientific basis for further revealing the biosynthesis and release mechanisms of sex pheromone in.【Method】The full cDNA sequence ofwas cloned by RACE technique. Gene splicing and amino acid sequence were analyzed by the software of DNAMAN 6.0, protein secondary structure prediction ofand bioinformatics information were predicted using Protparam and Chou & Fasman. The expression patterns ofin different developmental stages ofwere detected and the effects of mating behavior and cotton volatiles on the expression level ofwere analyzedusing real-time quantitative PCR (qRT-PCR). 【Result】The full cDNA sequence of(Genbank accessionnumber: KY987647) is obtained, and the total length of cDNA is 1 461 bp. The open reading frame (ORF) is 618 bp, encoding 205 amino acid residues. The length of 5′-untranslated region (5′ UTR) and 3′-untranslated region (3′ UTR) is 121 and 722 bp, respectively. The amino acid sequence encoded bycontains five peptides, including diapause hormone homolog,-SGNP,-SGNP, PBAN and-SGNP, and a signal peptide of 23 amino acid residues at the N terminus. The predicted molecular mass and isoelectric point are 2.41 kD and 9.25, respectively. Homology and phylogenetic tree analysis showed that PgosPBAN and PBAN of 15 Lepidoptera insects were located in the same branch, and PgosPBAN had the closest relationship withPBAN (GenBank accessionnumber: ALM30314.1), suggesting that the two genes likely developed from a common ancestral gene.The expression ofwas specific in different developmental stages, which was higher in adult stage, second in larval stage, and the lowest in pupal stage.was expressed in both female and male adults,and the expression ofin male adults was significantly higher than that in female adults from the 1st-day to 5th-day old. The expression level ofinat 1-3 days after mating was significantly higher than that in virgin moth. After exposed to cotton volatiles for 1-5 days, the expression level ofin male adults had no significant difference compared with the control, but the expression level ofat 1st, 8th day of female adults and 8th day of male adults was significantly lower than that in control. 【Conclusion】The sequence characteristics of nucleotides and amino acids ofwere clarified, and the secondary structure characteristics of the proteinwere analyzed. According to the expression ofin different developmental stages ofand its relationship with mating behavior and the regulation of cotton volatiles, it is speculated that this gene is not only involved in the synthesis and release of female pheromone in, it may also play an important role in regulating male pheromones and regulating growth and development.

pink bollworm ();pheromone biosynthesis activating neuropeptide (PBAN); expression analysis; mating behavior; cotton volatiles

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.23.005

2018-08-06；

2018-09-19

国家重点研发计划（2017YFD0201907）、国家棉花产业技术体系（CARS-15-18）

许冬，E-mail：ztb799@163.com。

万鹏，E-mail：wanpenghb@126.com

（责任编辑 岳梅）