黄连水煎液微粒体系对大鼠小肠上皮细胞紧密连接结构与紧密连接蛋白ZO-1表达的影响

徐慧慧，杨 晔，陈青青，任蓉蓉，尹登科，桂双英

(安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012)

毛茛科植物黄连的干燥根茎，具有清热、泻火等功效[1]。从黄连中提取出的一种天然异喹啉类生物碱黄连素又称小檗碱，具有清热解毒、抗菌、抗肿瘤等药理作用，已被广泛应用于临床[2]。但由于小檗碱脂溶性差、溶解度低[3]，以及受到肠道外排转运蛋白影响等因素的制约，存在口服吸收差、生物利用度低等问题[4]。

小檗碱主要以被动扩散的细胞旁路途径被小肠上皮细胞摄取和转运，其肠吸收效果主要取决于小肠上皮细胞间渗透性[5]。而小肠上皮细胞间渗透性主要由细胞间紧密连接决定。细胞间紧密连接结构由跨膜闭锁蛋白(occludin)、紧密连接蛋白ZO-1(zonula occludens-1，ZO-1)、连接黏附分子(junction adhesion molecule, JAM)等组成[9]，其中ZO蛋白家族是最早被发现且被研究最为深入的紧密连接蛋白[10]。ZO-1蛋白表达的下调或活性降低，均会影响细胞间紧密连接结构的完整性，从而调节肠黏膜屏障功能[11]。

隗丽等[6]研究发现，黄连水煎液中小檗碱的渗透性大于小檗碱单一成分，肠吸收效果得到明显改善。课题组前期研究也发现，中药汤剂在煎煮过程中会形成许多以多糖、蛋白质为主要物质的微粒体系[7]，且中药汤剂微粒体系可显著促进经细胞旁路途径吸收的小分子药物的肠吸收[8]。为阐明黄连汤剂微粒体系影响活性成分肠吸收的作用机制，本实验以中药材黄连与其活性成分小檗碱为研究对象，对其进行常规煎煮制备黄连水煎液，以此来研究水煎液微粒体系对大鼠小肠紧密连接结构和相关蛋白ZO-1表达的影响。

1 材料

1.1 仪器 HL-2恒流泵：上海嘉鹏科技有限公司；ZD-88B恒温摇床：江苏省太仓市博莱特实验仪器厂；HH数显恒温水浴锅：浙江省金坛市金城国胜实验仪器厂；HT-7700透射电子显微镜：日本日立Hitachi；超博切片机：德国徕卡Leica；FD-ID-50冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机：湖南省长沙湘仪离心机仪器有限公司；ZEN3690激光散射粒度仪：英国Malvern公司；SPM-8100FM高分辨原子力显微镜：日本岛津。

1.2 药材、药品与试剂 黄连：原中药材经安徽中医药大学刘守金教授鉴定为毛茛科植物黄连(CoptischinensisFranch.)的干燥根；小檗碱原料药(批号 YSBJ20170617，质量分数≥98%)：英达试剂有限公司；山羊血清(批号 C0265)：碧云天生物技术有限公司；兔抗TJP1/ZO-1抗体(批号 PB0231)、浓缩型二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(批号135911B)：武汉博士德生物公司；通用型试剂盒PV-6000：北京中杉金桥生物技术有限公司；水为Mill-Q超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.3 动物 健康成年SD大鼠24只，体质量(220±30)g，由安徽医科大学实验动物中心[动物生产许可证号：SCXK(皖)2017-002]提供。实验前禁食12 h，自由饮水。

2 方法

2.1 黄连水煎液及其固体微粒、除微粒水煎液的制备 ①取黄连粗粉2.5 g于烧杯中，加50 mL蒸馏水，煮沸后文火煎煮1.5 h，4层纱布过滤；药渣再次加50 mL蒸馏水，重复上述操作，合并两次滤液，浓缩至10 mL，得黄连水煎液(全煎液)。②取2 mL黄连水煎液，离心(12 000 r/min，10 min)，取沉淀为黄连水煎液中固体微粒体系，以2 mL蒸馏水重悬，即为微粒悬浮液。③取2 mL黄连水煎液，依次经过0.45、0.22、0.10 μm微孔滤膜滤过，去除微粒体系后，得到不含固体微粒的黄连水煎液(除微粒水煎液)。

2.2 黄连水煎液中固体微粒体系的表征 取“2.1”项中全煎液和微粒悬浮液经过适当稀释后用ZEN3690激光散射粒度仪检测溶液中微粒的Zeta电位和粒径分布(见图1)。取“2.1”项中微粒悬浮液，SPM-8100FM高分辨原子力显微镜观察其结果(见图2)。

2.3 大鼠在体肠循环灌注实验

2.3.1 肠循环灌注液配制 取全煎液、除微粒水煎液和微粒悬浮液各1 mL，蒸馏水稀释250倍，然后配制成Kreb-Ringers(K-R)液，形成灌注体系为全煎液组、除微粒水煎液组和微粒悬浮液组。同时设置空白K-R液作为对照组。

2.3.2 手术方法 SD大鼠禁食(自由饮水)12 h后，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后固定，沿腹中线打开腹腔，暴露小肠，量取10 cm左右空肠(自幽门15 cm起往下10 cm止)，两端切口，用预热至37 ℃生理盐水冲洗肠段内容物后，切口两端插管，结扎固定。伤口用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖保湿，保温37 ℃。以各组灌注液35 mL进行肠循环灌注，流速为0.2 mL/min，待灌注液分别灌满肠道后开始计时，在2 h后取下肠段并处死大鼠。将取出的肠段用生理盐水冲洗干净，用锋利的刀片取下约1 cm×1 cm大小的组织放入锇酸固定液中固定，用于透射电子显微镜观察。另取1 cm×1 cm的空肠组织，置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋、切片，用于ZO-1蛋白的免疫组织化学检测。

2.4 透射电子显微镜下观察小肠上皮细胞紧密连接结构 将固定好的组织用磷酸缓冲液冲洗2次，每次20 min；4 ℃冰箱内，使用50%、70%、80%、90%、100%的丙酮溶液进行逐级梯度脱水10 min；室温下100%丙酮脱水10 min；37 ℃温箱包埋，以混合包埋剂(包埋剂与丙酮比例分别为1∶1、3∶1)和纯包埋剂各包埋1、3、5 h；于37 ℃温箱12 h，60 ℃温箱 36～48 h加温聚合；用超薄切片机切片，再经乙酸铀和枸橼酸铅双重染色法染色；于透射电子显微镜下观察，随机选取镜下6个不同位置的细胞间缝隙，以Adobe Photoshop 10.0软件计算细胞间缝隙宽度。

2.5 ZO-1蛋白的免疫组织化学法检测 采取SABC法，将固定好的石蜡切片常规脱蜡、脱水；将组织切片浸入组织抗原修复液(0.01 mol/L枸橼酸钠溶液，pH 6.0)中，调节水温达95 ℃左右，水浴20 min进行抗原热修复，取出切片，自然冷却到室温；每张切片滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min，PBS缓冲液中冲洗3次，每次3 min；滴加10%山羊血清封闭液，室温孵育20 min；滴加兔抗ZO-l多克隆抗体(1∶100)，4 ℃过夜16 h以上，PBST缓冲液冲洗3次，每次3 min；滴加HRP标记山羊抗小鼠IgG(1∶100)，37 ℃孵育20 min，PBST缓冲液冲洗3次，每次3 min；DAB显色5 min，苏木素复染后脱水、透明，中性树脂封片，倒置电子显微镜下观察蛋白阳性表达水平。每组随机选择6张较为清晰的切片，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，测定各切片中阳性细胞的积分光密度。

3 结果

3.1 黄连水煎液中微粒体系的表征 如图1所示，全煎液组双峰粒径分别为(162.2±24.3)、(1 106.0±38.9)nm，Zeta电位为(-21.40±0.26)mV；微粒悬浮液组双峰粒径分别为(191.8±22.4)、(1 025.0±32.5)nm，Zeta电位为(-22.3±0.18)mV，微粒粒径均呈现出双峰分布，其大小不一，分布范围广；电位值基本相同。全煎液组和微粒悬浮液组粒径与Zeta电位比较，差异均无统计学意义(P>0.05，n=3)。结果说明微粒悬浮液可等同于全煎液中微粒体系。除微粒水煎液组未检测到微粒存在。如图2所示，中药汤剂微粒的形态特征与粒径检测结果相一致，微粒大多为类圆形，粒径分布范围广。

注：A1，全煎液组粒径分布图；A2，全煎液组表面Zeta电位分布图；B1，微粒悬浮液组粒径分布图；B2，微粒悬浮液组表面Zeta电位分布图

图1 全煎液(A)和微粒悬浮液(B)的粒径分布与表面Zeta电位

注：A. 微粒的二维扫描图；B. 图A中两个较大微粒的高度图；C. 图A中黑色方框内的三维放大图；D. 图C中微粒的高度图

图2微粒悬浮液的原子力显微镜检测结果

3.2 透射电子显微镜下观察小肠上皮细胞紧密连接结构的变化 透射电子显微镜下发现，空白对照组和去微粒水煎液组空肠上皮细胞与细胞间连接紧密，全煎液组和微粒悬浮液组空肠上皮细胞与细胞间连接缝隙增大，见图3。全煎液组和微粒悬浮液组细胞间缝隙宽度显著高于空白对照组与去微粒水煎液组(P<0.05)。见图4。

3.3 免疫组织化学染色法观察小肠上皮ZO-1蛋白表达水平 ZO-1蛋白均匀分布于肠上皮细胞周围，呈蜂窝或者点状聚集。与空白对照组比较，全煎液组和微粒悬浮液组ZO-1表达水平显著降低(P<0.05)，去微粒水煎液组ZO-1表达水平无明显变化(P>0.05)。

4 讨论

肠上皮细胞通透性是药物经细胞旁路途径转运的主要影响因素，紧密连接是相邻上皮细胞间最重要的连接方式。紧密连接结构位于上皮细胞间的顶端，可以在细胞侧空间形成调控屏障，调节水、离子和大分子物质的跨膜转运。因此，紧密连接结构对许多以被动扩散为主要方式穿过细胞间紧密连接的药物跨膜转运具有重要的调节作用。本实验中小檗碱也属于此类药物。肠上皮细胞间紧密连接是由多种蛋白组成的一个多功能复合体，并受到体内多个信号传导通路的动态调节，从而实现对药物、营养成分和病原体等的经小肠渗透或拦截。药物与其非活性成分一同经口服后进入肠道，改变肠道内微环境，激活肠道免疫系统并释放某些效应因子以调控上皮细胞紧密连接结构，从而调节活性药物的经细胞旁路途径的转运。

图3透射电子显微镜下空白对照组(A)、全煎液组(B)、去微粒水煎液组(C)和微粒悬浮液组(D)大鼠空肠上皮细胞紧密连接结构

注：与空白对照组比较，*P<0.05

图5空白对照组(A)、全煎液组(B)、去微粒水煎液组(C)和微粒悬浮液组(D)大鼠空肠上皮细胞ZO-1蛋白表达水平(免疫组织化学染色，10×40倍)

注：与空白对照组比较，*P<0.05

本实验结果显示，黄连汤剂微粒体系可使上皮细胞间紧密连接结构发生改变，细胞与细胞间的缝隙增大，免疫组织化学检测结果也显示肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1的表达水平降低。这一结果表明，黄连水煎液固体微粒可直接或间接影响细胞间紧密连接结构的改变，使细胞渗透性增加，促进小檗碱的肠吸收，这一结果与本课题组前期研究结果相一致。但黄连水煎液中微粒体对细胞间紧密连接结构影响的具体机制尚不明确。根据本实验结果推测，黄连水煎液固体微粒体系可以在一定程度上调控肠道屏障，使肠上皮细胞间的渗透性增加，从而促进小分子药物的经细胞旁路途径的转运，提高药物的生物利用度。关于黄连多糖微粒影响肠上皮细胞通透性的吸收机制尚需进一步研究。