蒲公英甾醇通过ROS/ERK/iNOS途径保护Hp相关性胃炎大鼠胃黏膜的实验研究

陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046

幽门螺旋杆菌相关性胃炎是指与幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染相关的胃黏膜急慢性炎症或萎缩性病变[1]。Hp感染后可激发机体发生氧化应激(reactive oxygen species，ROS)反应，生成的一氧化氮(Nitric Oxide，NO)、超氧化物(Superoxide，O2-)等产物是造成胃黏膜损伤，导致胃炎发生的重要因素[2-3]。NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成的，其中由iNOS活化后产生的过量NO发挥有害效应。因此iNOS表达量是NO异常产生的关键[4]。ERK是促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中成员之一。它磷酸化后激活，激活的ERK1/2介导多种生物学反应[5-6]。大量研究证明，ROS是导致ERK1/2磷酸化的重要激活剂[7]，而ERK1/2激活后又加剧了ROS对胃黏膜的损伤，抑制了胃黏膜的修复，引起急慢性胃炎，甚至出现细胞的过度增值分化[8]。蒲公英作为传统的中草药具有广泛的药理活性[9]，研究表明，蒲公英甾醇具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理作用[10]。本实验中蒲公英甾醇通过ROS/ERK/iNOS途径减轻HP相关性胃炎大鼠胃黏膜的氧化损伤，保护胃黏膜。为中草药蒲公英资源的有效开发和合理应用提供了实验依据。

1 材料与仪器

1.1 动物 成年雄性清洁级SD大鼠(220-240g)48只，购自西安交通大学实验动物中心，许可证号:SCXK (陕) 2012-003。实验室饲养温度(20±2)℃，所有动物适应性喂养1周。

1.2 药品与试剂 快速尿素酶试验试剂盒(安信生物技术有限公司)，蒲公英甾醇纯度≥98%(成都瑞芬思生物科技有限公司)，抗体：iNOS (sc-5302)、NOX2 (sc-20782)、ph-ERK1/2(sc-16982)、NOX4 (sc-21860)、SOD (sc-17767)。

1.3 仪器 DXM1200F光学显微镜(尼康)，TS100倒置显微镜(尼康)，KD2800低温恒冷切片机，GENIUS 16K台式高速离心机，TP1020脱水机，ZMN200烘片机，5010 型石蜡切片染色机，微波炉，高压锅，恒温水浴箱，WB机(Bio-Rad, USA)。

2 方法

2.1 造模 48只大鼠随机分成正常组、正常+蒲公英甾醇组、模型组、模型+蒲公英甾醇组，每组各12只。参考文献[11]对模型组及模型+蒲公英甾醇组大鼠进行造模。造模大鼠禁食12 h后用NaHCO3+消炎痛溶液0.5 mL/只进行灌胃，然后禁食6 h，以HP菌液(含量109/mL)1.5 mL/只灌胃，再禁食、禁水4 h，隔天1次,连续10 d，正常组及正常+蒲公英甾醇组大鼠常规喂养。4周后，每组随机处死2只大鼠，取出鼠胃并沿胃大弯剪开,取一半胃黏膜组织做快速尿素酶实验、黏膜涂片革兰染色，以判断胃窦黏膜HP定植情况；取另一半胃黏膜组织,用4%多聚甲醛固定24 h后进行病理组织学检查。造模组大鼠胃窦黏膜变薄，有中度慢性活动性炎症和中度萎缩，上皮糜烂，固有层充血，中性粒细胞和淋巴细胞浸润等不同程度炎性改变，正常组的大鼠胃黏膜切片未见胃炎的病理改变。

2.2 给药 正常+蒲公英甾醇组与模型+蒲公英甾醇组大鼠按10 mg/kg·d蒲公英甾醇，正常组和模型组用等体积生理盐水于每天上午9～10时灌胃，连续给药4周。

2.3 Western Blot检测 取胃组织匀浆后测定蛋白含量，制备SDS-PAGE胶，蛋白变性、上样、电泳、转膜、封闭加一抗过夜，TBST洗膜，二抗封闭，TBST洗膜，发光。分别测定ph-ERK1/2、iNOS、NOX2、NOX4、SOD蛋白的含量。以β-actin作为内参，使用Image J分析软件，计算每一样本蛋白的相对表达量。

3 结果

3.1 对Hp相关性胃炎大鼠胃黏膜的NOX2含量的影响 由表1、图1可知，模型组大鼠NOX2的含量明显高于正常组及正常+蒲公英甾醇组大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇组的NOX2含量明显低于模型组(P<0.05)，而与正常组及正常+蒲公英甾醇组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠胃黏膜NOX2、NOX4、iNOS、SOD、t-ERK、ph-ERK蛋白的表达 (%,±s)

注：与正常组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

3.2 对Hp相关性胃炎大鼠胃黏膜的NOX4含量的影响 由表1、图2可知，模型组大鼠NOX4的含量明显高于正常组及正常+蒲公英甾醇组大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇组NOX4含量明显低于模型组(P<0.05)，而与正常组及正常+蒲公英甾醇组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

3.3 对Hp相关性胃炎大鼠胃黏膜iNOS含量的影响 由表1、图3可知，模型组大鼠iNOS的含量明显高于正常组及正常+蒲公英甾醇组大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇组的iNOS含量明显低于模型组(P<0.05)，而与正常组及正常+蒲公英甾醇组之间无统计学差异(P>0.05)。

3.4 对Hp相关性胃炎大鼠胃黏膜SOD含量的影响 由表1、图4可知，模型组大鼠SOD的含量明显低于正常组及正常+蒲公英甾醇组大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇组的SOD含量明显高于模型组(P<0.05)，而与正常组及正常+蒲公英甾醇组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

3.5 对Hp相关性胃炎大鼠胃黏膜的ph-ERK1/2、t-ERK1/2含量的影响 由表1、图5可知，模型组大鼠ph-ERK1/2的含量明显高于正常组及正常+蒲公英甾醇组大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇组的ph-ERK1/2含量明显低于模型组(P<0.05)，而与正常组及正常+蒲公英甾醇组之间无统计学差异(P>0.05)，各组间t-ERK1/2的含量差异无统计学意义(P>0.05)。

4 讨论

幽门螺旋杆菌(Hp)是最常见的传染性病原菌之一，全球有超过50%的人群感染,我国的平均感染率高达56%[12]。研究表明，在Hp引起的胃黏膜损伤中，氧化应激起了十分重要的作用，首先，氧自由基可形成大量的脂质过氧化物，损伤细胞内线粒体和溶酶体，引起胃黏膜血流障碍，导致黏膜损伤。其次，氧自由基也可破坏上皮间质透明质酸酶和胶原纤维网而引起胃黏膜的进一步损害[8]。NADPH氧化酶是消化道黏膜ROS的重要来源，它的激活是组织内活性氧簇产生的重要原因之一，NADPH氧化酶(NOX)家族有7个成员(NOX1，NOX2，NOX3，NOX4，NOX5，DUOX1，DUOX2)，在消化道中存在的NOX家族成员主要是NOX2和NOX4。它们是消化系统疾病中ROS产生的主要来源[13]。当Hp进入机体后被中性粒细胞迅速吞噬，形成吞噬体，通过NAD(P)H氧化酶系统，增加过氧化物、一氧化氮等产物的产生，致使胃黏膜受损。而超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是生物体内氧自由基清除的首要防线，它可降低氧化应激对细胞膜的损害并且能够修复受损的细胞，起到保护胃黏膜的作用[14]。

iNOS是诱导型一氧化合酶(NOS)，可在内毒素、脂多糖、ROS等多种外界因素的刺激下被激活，生成大量的NO，而高浓度的NO对胃黏膜细胞有毒性作用，引起胃黏膜的损伤[4]。ERK是将细胞外信号转导到细胞内部的重要物质，已有研究证明，ERK通路活性增高不仅可促进胃黏膜细胞的增殖，而且该通路的激活对于胃黏膜的损伤也具有重要意义[7]。Hp定植胃黏膜后，胃黏膜ROS明显增加，引发胃黏膜血流障碍，导致胃黏膜损伤。同时ERK通路被激活，从而使细胞外信号转导到细胞内，促进多种核内转录因子磷酸化，调控基因表达，加剧胃黏膜的损伤，抑制胃黏膜的修复，引起急慢性胃炎，甚至出现细胞的过度增值分化。

目前现代医学对Hp感染的标准三联疗法面临着Hp对抗生素的耐药问题,而耐药性是导致Hp根除失败的主要原因。蒲公英作为传统的中草药其主要活性成分蒲公英甾醇被证明具有抗氧化、抗炎的重要药理作用，而被临床上广泛应用。本试验结果表明，蒲公英甾醇能够明显减少Hp相关性胃炎大鼠胃黏膜的NOX2、NOX4、iNOS和ph-ERK1/2的表达，增加SOD的表达，因此我们认为蒲公英甾醇可通过ROS/ERK/iNOS途径减轻Hp相关性胃炎大鼠胃黏膜的氧化损伤，保护胃黏膜。这为其作为该疾病的防治药物提供了新的理论和实验依据。