朝天罐提取物体外抗肿瘤活性研究

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1.广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021；2.广西医科大学，广西 南宁 530021；3.广西医科大学附属武鸣医院，广西 南宁 530199

朝天罐为野牡丹科金锦香属植物朝天罐OsbeckiaopiparaC.Y. Wu et C.Chen的根，主产于贵州、广西、广东、台湾及长江流域以南各省区[1-2]，可用于治腰膝酸软、咯血、痢疾、咽喉痛、小儿风热、久咳、咯血、胃痛、白带、月经不调、胎漏下血、痔疮出血及癌症等[3-5]，为广西瑶族地区的常用药材。课题组前期研究发现，朝天罐根水提物对小鼠耳廓肿胀、腹腔毛细血管通透性及棉球肉芽肿等急、慢性炎症模型具有显著的抑制作用，其抗炎作用机制与抑制炎症组织中PGE2生成有关[6]。为了探讨朝天罐的抗肿瘤活性，实验研究了朝天罐水提取物对人肝癌细胞7721、人鼻咽癌细胞CNE-2增殖率、集落形成率的影响，并用Hoechst33342荧光染色法检测其对肿瘤细胞的促凋亡作用，旨在为药材的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料

1.1 细胞株 人肝癌细胞SMMG-7721、人鼻咽癌细胞株CNE-2购自中科院上海细胞库。

1.2 药品与试剂 朝天罐(采于广西金秀瑶族自治县，经广西医科大学天然药物与生药学教研室焦爱军教授鉴定为朝天罐根。按文献方法[6]，取药材1000 g，加10倍量水浸泡30 min，煮沸，维持1 h，纱布过滤，药渣再加入5倍量水，煮沸，维持30 min，纱布过滤，合并滤液，浓缩至1000 mL，冷却后，4 ℃冰箱放置备用。RPMI 1640 培养基(美国 Hyclone 公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；青霉素、链霉素(北京索莱宝科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶(美国Thermo Fisher公司)；CCK-8(上海尚宝生物科技有限公司)；Hoechst 33342(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.3 仪器 CO2培养箱(美国Termo Forma公司)；酶标仪(香港分子仪器公司)；荧光倒置显微镜(日本 Olympus公司)。

2 方法

2.1 细胞培养 细胞接种在25 cm2培养瓶中，所用培养基含有RPMI 1640培养基、10%(V/V) 胎牛血清与 1%(V/V)青霉素-链霉素，在 37℃、5%(V/V)CO2培养箱中培养。

2.2 朝天罐对肿瘤细胞增殖活性的影响

2.2.1 CCK-8法检测细胞增殖抑制率 取处于对数生长期的细胞，接种于96孔培养板，每孔加入50×103个细胞。 设空白组和不同浓度的给药组，待细胞贴壁，加入不同浓度的药物。药物作用24 h后吸出培养基，每孔加入CCK8 10 μL，在培养箱中孵育15 h，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，计算细胞生长抑制率。使用Graphpad 软件计算半数抑制浓度(IC50)。

细胞存活率(%)=OD试验组/OD对照组×100%

细胞生长抑制率(%)=(1- OD试验组/OD对照组)×100%

2.2.2 单细胞集落形成实验 取处于对数生长期的细胞，接种于6孔培养板，每孔加入300个细胞。设空白对照组和不同浓度的给药组，待细胞贴壁，加入不同浓度的药物。药物作用24 h后吸出培养基，同时加入5 mL新鲜培养基，培养7 d后吸出培养基，用甲醇在-20 ℃条件下固定细胞30 min，加入结晶紫染色15 min， PBS清洗2次后，记录每孔细胞团(细胞数>50个)的数目，计算集落形成抑制率。

抑制率(%)=(1-试验组集落数/对照组集落数)×100%

2.3 Hoechst 33342 染色检测细胞凋亡 取处于对数生长期的细胞，接种于6孔培养板，每孔加入30 ×105个细胞。设空白对照组和不同浓度的给药组，细胞贴壁后，加入不同浓度的药物。药物作用 24 h后吸出培养基，用PBS 清洗1次，每孔加入PBS(含 1 g/L Hoechst 33342)，在37 ℃培养箱中避光孵育 10 min。用 PBS清洗2次，在激发波长350 nm，发射波长460 nm 的荧光显微镜下随机拍照。

3 结果

3.1 CCK-8法检测细胞增殖抑制率 CCK-8法细胞活力检测结果显示，经不同浓度的CTG处理24 h后，SMMG-7721的OD值与对照组相比呈现下降趋势，且在1.25 mg/mL的浓度以上呈现明显的浓度依赖性关系，2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL分别对应的OD值为0.942±0.042、0.87±0.015、0.750±0.038、0.426±0.065。经计算IC50值为13.915 mg/mL，见表1。CNE-2细胞的OD值相较于对照组也呈现下降趋势，且在浓度大于1.25 mg/mL时，开始出现明显的浓度依赖性关系，2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL分别对应的OD值为0.767±0.022，0.691±0.022,0.643±0.031,0.518±0.029，计算IC50为19.896 mg/mL。见表2。

表1 朝天罐水提物对7721细胞增殖的影响 (x±s，n=6)

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

表2 朝天罐水提物对CNE-2细胞增殖的影响 (x±s，n=6)

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

3.2 单细胞集落形成实验 细胞克隆形成实验结果表明，在CTG处理24 h后撤除药物继续培养，依然能明显的抑制SMMG-7721和CNE-2细胞克隆团的形成，与对照组相比，呈剂量依赖性，其中SMMG-7721细胞在0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL的药物浓度处理下分别对应的抑制率为9.17%、17.16%、38.46%、58.28%，详见表 3。CNE-2细胞在0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL的药物浓度处理下分别对应的抑制率为5.29%、28.14%、47.35%、62.75%，详见表 4。

表3 朝天罐水提物对7721细胞集落形成影响 (x±s，n=3)

注：与空白对照组比较**P<0.01。

表4 朝天罐水提物对CNE-2细胞集落形成影响 (x±s，n=3)

注：与空白对照组比较，**P<0.01。

3.3 朝天罐水提物对细胞凋亡的影响 Hoechst 33342是一种可以穿过细胞膜与染色质结合的蓝色荧光染料。细胞染色后通过荧光显微镜观察，结果显示正常未给药组细胞内荧光较弱，细胞核形态正常，CTG作用48 h后细胞内荧光强度随CTG浓度的提高而出现增强，并伴有细胞核形态出现异常，核凝缩的现象，提示CTG对SSMG-7721和CNE-2细胞的DNA具有损伤作用。见图1和图2。

4 讨论

研究采用CCK-8细胞活力检测实验，细胞克隆形成实验评价CTG体外抑制肿瘤细胞增殖作用，结果显示，经不同的药物浓度CTG处理24 h后，人肝癌细胞SMMG-7721、人鼻咽癌细胞CNE-2的增殖活性均受到明显抑制，且抑制作用与药物浓度呈依赖关系。采用Hoechst33342染色法观察CTG对肿瘤细胞的促凋亡作用，结果发现，SMMG-7721、CNE-2细胞的细胞核出现明显的细胞破碎，核凝缩现象，表明CTG提取物可引起DNA损伤，从而引起细胞凋亡。由此提示，CTG可能通过诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。本实验仅对CTG水提物体外抗肿瘤作用进行了初步探讨，其抗肿瘤作用的活性成分、具体作用机制及体内抗肿瘤活性尚待进一步研究。