唐菖蒲伯克霍尔德氏菌三种鉴定方法的比较

赵梦馨，周帼萍*，黄庭轩，王安琪，杨祖顺，国译丹，范 璐

（1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2.University High School，Irvine CA 92612；3.云南省疾病预防控制中心食品安全与营养研究中心，云南 昆明 650022）

高产、营养、美味的玉米是很多国家和地区的主食之一，其各种深加工制品也深受消费者喜欢，由玉米制作的吊浆粑（也称酵米面）是一种在南方部分地区广为盛行的自制发酵食物，吊浆粑在制作及保存过程中很容易被唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli）污染，导致食物中毒，甚至致死。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌广泛存在于自然环境（土壤、水源等）[1]、医院环境[2-5]及食品（银耳等）[6]中，致病力非常复杂，该菌导致的食物中毒事件在我国时有发生。我国现行国家标准GB/T 4789.29—2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》[7]称其病原菌为椰毒假单胞菌（Pseudomonas cocovenenans）或椰毒假单胞菌酵米面亚种（P.cocovenenans subsp.farinofermentans），但国际微生物分类命名系统已将原椰毒假单胞菌改名为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，所以国外文献资料及进口微生物鉴定设备数据库中均废止了椰毒假单胞菌名称[8]。

现有的微生物鉴定方法很多，李晓琍等[9]采用于马玲薯葡萄糖琼脂培养基中添加抗生素的方法优化对B.gladioli的检出；NADINEM等[10]对印尼食物中毒事件中的分离株B.gladioli进行全基因组测序分析，确定其菌株同源性；FALCONERT M等[11]采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法得出导致食物中毒的非洲粟酒中病原菌为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，以上鉴定方法各有其优点。生理生化鉴定是微生物鉴定的经典方法，由于其对设备要求低，也是实验室采用的基本鉴定方法。随着实验条件的改进和设备升级，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）等设备昂贵的质谱鉴定法也开始应用。而价格低廉、准确，鉴定种类和适用性更为广泛的管家基因序列分析等基于测序的分子生物学方法则广受欢迎。

本研究采用VITEK 2 COMPACT生理生化、MALDITOF-MS和rec A序列分析3种方法对云南省疾控中心提供的13株疑似唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（B.gladioli）进行鉴定，并比较和评价这3种方法在唐菖蒲伯克霍尔德氏菌鉴定方面的优缺点，旨在探究出能够快速、准确鉴别唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的方法，对该菌株的常规检测和疾病控制有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

标准及参照菌株：用于质谱鉴定和聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR）扩增的阳性对照菌株编号及来源见表1。

表1 本实验所用标准及参比菌株Table 1 Standard strains and reference strains used in the experiment

疑似菌株：云南疾控中心。其中菌株WS24、WS32来源于土壤，菌株HH18、HH19、WS18、WS22、WS26、WS34来源于玉米面、菌株WS03、WS23、WS27来源于玉米杆，菌株WS09来源于吊浆粑，菌株HH08来源于吊浆糯米面。

质控菌株ATCC 29522为大肠杆菌（Escherichia coli）：由云南省疾控中心提供。

1.1.2 试剂

马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextroseagar，PDA）培养基：英国OXOID公司；GVC增菌液和卵黄琼脂平板：北京陆桥技术公司；VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡：法国梅里埃公司；Premix Taq、DL2000脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、核酸染料Goldview：日本TaKaRa公司；琼脂糖（生化试剂）：西班牙Biowest公司；甲酸（formic acid，FA）、三氟乙酸（trifluoracetic acid，TFA）、乙腈（acetonitrile，ACN）、无水乙醇、基质2-氰基-4-羟基肉桂酸（2-cuano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）（均为色谱纯），细菌质控标准品（bacterial test standard，BTS）：德国布鲁克公司；PCR引物：金唯智科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1FD洁净工作台：苏净集团苏州安泰空气净化技术有限公司；VITEK 2COMPACT全自动微生物鉴定仪：法国梅里埃公司；Cycler PCR仪：美国Bio-Rad公司；BIOBEST 1200A凝胶图像分析系统：美国西蒙公司；Autoflex Speed基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪：德国布鲁克公司。

1.3 方法

1.3.1 生理生化鉴定

按照VITEK 2 COMPACT全自动微生物分析仪的说明书对13株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的疑似菌株进行生理生化鉴定，并结合GB/T 4789.29—2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》及伯杰氏手册[12]对13株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的疑似菌株生理生化特性进行分析。

1.3.2 MALDI-TOF-MS鉴定

标准溶液：50%乙腈、2.5%三氟乙酸和47.5%超纯水；基质溶液：用250μL标准溶液溶解CHCA成品，混匀，保存备用。用50μL标准溶液溶解2μL BTS标准品，反复吹打混匀，注意避免出现气泡，静置5 min后再吹打不少于20次，每管分装5μL，置于-20℃保存备用。

将13株疑似菌株接种于PDA培养基，于36℃培养箱中培养48 h。采用甲酸萃取法[13]进行样品制备：用无菌棉棒挑取适量菌落（约5 mg）放入1.5 mL Eppendorf管中，加入300μL纯水混匀，再加入900μL无水乙醇混匀，12 000 r/min离心2 min，弃上清，再向管中加入50μL 70%的FA和50μL ACN，12 000 r/min离心2 min，取上清液转移到新Eppendorf管中。取1μL上清液加在MALDI-TOF-MS的样品靶上，在室温条件下自然晾干，晾干后立即滴加1μL基质溶液均匀覆盖，自然晾干后备用。同时，以上述同样方法向靶上滴加溶解后的BTS进行校正。实验重复3次。

用溶解后的BTS对仪器进行校准后，应用MALDI Biotyper软件对样品图谱信息进行采集和分析，并自动鉴定菌种结果。

1.3.3 rec A序列分析

将13株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的疑似菌株划线于PDA平板，于37℃条件下培养24 h，挑取单菌落于装有50μL MilliQ水的PCR管中，摇匀后于98℃条件下裂解10 min后，12 000 r/min离心5 min，上清液为疑似菌株的DNA模板，冷藏于4℃冰箱，待用。

rec A PCR扩增体系：2×Taq PCRMaster Mix 25μL，正向引物rec A-F（5′-GATAGCAAGAAGGGCTCC-3′）2 μL，反向引物rec A-R（5′-CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC-3′）[14]2μL，DNA模板5μL，加无菌水至50μL。

rec A PCR扩增条件：94℃、5min；94℃、30s，59℃、30s，72 ℃、45 s，循环30次；72 ℃、5min。

所得PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶进行检测。将PCR扩增产物送至苏州金唯智公司进行测序。所得序列提交至GenBank，用MEGA6.0软件中的邻近法（neighbor joining，NJ）法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 生理生化鉴定结果

13株疑似唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株的生理生化鉴定结果见表2，其中存在差异的生理生化指标测定结果见表3。

表2 VITEK 2 COMPACT生理生化试验结果Table 2 Results of VITEK 2 COMPACT physiological and biochemical tests

表3 分离株的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of isolated strains

由表2和表3可知，13株疑似菌株中8株（WS03、WS09、WS22、WS32、WS34、HH18、HH08、HH19）被鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderiagladioli），其生理生化特性和标准株CICC10574基本相同，但有5株（WS18、WS23、WS24、WS26、WS27）疑似菌则被鉴定为栖稻假单胞菌（Pseudomonas oryzihabitans）。

目前生理生化依然是国内外各种标准中的主要方法，也是基层实验室的主要甚至是唯一方法，所以比较了伯杰氏手册、VITEK 2 COMPACT系统和国标对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生理生化特性的描述。VITEK 2 COMPACT的47个生理生化特性中，13株唐菖蒲伯克霍尔德分离株和标准株CICC10574在侧金盏花醇、谷氨酰芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶、D-山梨醇、丙二酸盐醇和香豆酸盐6个生理生化指标上有差异，其余41个指标则完全一致。其中影响最大的生理生化指标是D-山梨醇：伯杰氏手册（第九版）中描述唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的该项指标为阳性，故有35%的菌株（5/13）因D-山梨醇特性差异而被VITEK 2 COMPACT鉴定为栖稻假单胞菌（P.oryzihabitans），而其他5项生理生化特性的差异并未影响VITEK 2 COMPACT的最终鉴定结果。伯杰氏手册（第九版）中描述典型株ATCC10248的D-塔格糖和丙二酸盐两个生理生化特性指标为阳性，但被测的13株疑似菌株和1株标准菌株中0%和14.3%的菌株这两项为阳性；GB/T 4789.29—2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》要求唐菖蒲伯克霍尔德氏菌侧金盏花醇为阳性，实际上被测菌株中只有28.6%的菌株该项指标为阳性；但这3项生理生化指标的阴性结果并不影响VITEK 2 COMPACT鉴定疑似菌为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。这些生理生化特性的差异，尤其是国标和伯杰氏手册中提到的4项指标的差异值得高度重视，以免在生理生化鉴定中发生偏差。

2.2 MALDI-TOF-MS鉴定结果

参考VITEK2 COMPACT生理生化鉴定结果，以唐菖蒲伯克霍尔德氏菌标准株作为参比，对标准株和13株疑似菌株进行MALDI-TOF-MS鉴定，部分菌株的质谱图见图1，测定结果见表4。

匹配分数在2.300～3.000之间，表示极有可能的菌种鉴定；在2.000～2.299之间，表示保守的菌种鉴定或可能的菌种鉴定。由图1可知，13株疑似菌质谱图与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌标准株CICC10574基本一致，特别是VITEK 2 COMPACT鉴定为栖稻假单胞菌的5个疑似菌株和唐菖蒲伯克霍尔德氏菌标准株的峰图高度一致。由表4可知，13株疑似菌株的得分在2.000～3.000之间，其中标准株CICC10574的分值为2.105，VITEK 2COMPACT鉴定为栖稻假单胞菌的5株疑似菌株得分范围在2.200～2.400之间，平均值为2.300；VITEK 2 COMPACT鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德8株菌株得分范围在2.000～2.500之间，平均值为2.306，表明两者之间无显著性差异（P＞0.05）。因此，MALDI-TOF-MS鉴定13株疑似菌株为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderiagladioli）。

图1 部分菌株的MALDI-TOF-MS图Fig.1 MALDI-TOF-MS spectrum of some strains

表4 质谱最佳匹配菌株及其得分Table 4 Optimum matching strain and score by MS

续表

2.3 rec A序列分析

伯克霍尔德氏菌在16SrRNA序列上过于保守，不适合用于鉴定到种，故其他管家基因被开发用于种的鉴定，其中rec A序列已被证实在伯克霍尔德属内区分70多个种，具有很好的效果[15-17]。因此，在Genbank数据库中选取伯克霍尔德属内唐菖蒲伯克霍尔德种及其近源种菌株的rec A序列信息进行比对并构建进化树，结果见图2。

图2 rec A序列分析构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic trees based on rec A sequences analysis

由图2可以看出，以伯克霍尔德种内rec A序列分析所构建的进化树中13株疑似菌株与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（B.gladioli）的典型株LMG2216、曾是椰毒假单胞菌（Pseudomonas cocovenenans）的典型株LMG11626及数据库中其他唐菖蒲伯克霍尔德氏菌株高度同源，也与食物中毒致病分离株YDHH、YD1、YD2和YD4同源，却与同属其他种的菌株之间的区别非常明显，bootstrap值达到98，特别是与近源、在16SrRNA序列分析中很难区分的两种植物致病菌细菌水稻细菌性-谷枯病菌（B.glumae）和水稻幼苗枯萎的病原菌-植物伯克霍尔德（B.plantarii）区分度很高，说明rec A序列分析适合鉴定唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。

唐菖蒲伯克霍尔德种内菌株多样性也非常复杂，既有产毒的食源性致病株，也有植物致病株和环境分离株，系统发育树中，分离株HH08、WS03和WS09与两次食物中毒事件的致病菌株YD1、YD2、YD4和YDHH位于同一个进化分支上，并与产毒素的原椰毒假单胞菌典型株LMG11626近源；菌株WS34与美国唐菖蒲中分离出的植物病原菌LMG2216近源；而分离株WS22、WS23、WS24、WS27、WS32以及HH19与环境分离株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌CICC10574位于同一进化分支。这意味着rec A序列分析在区分唐菖蒲伯克霍尔德氏菌不同亚种、变种上有参考价值。

2.4 3种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌鉴定方法的比较

将3种不同鉴定方法的结果进行比较，发现MALDITOF-MS鉴定方法和rec A序列方法鉴定结果完全一致，因此，鉴定13株疑似菌株为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（B.gladioli）。但VITEK 2 COMPACT生理生化鉴定结果却与MALDITOF-MS鉴定方法和rec A序列方法的鉴定结果出现了很大的差异。

3种鉴定方法比较来看，分子生物学方法最为精确，适用性强，价格低廉。经典的16SrRNA序列分析有通用引物，可鉴定到属，且几乎所有原核微生物的16SrRNA都在GenBank等免费开放性数据库中可供比较[18]；但是保守序列因为序列保守性低，不适合鉴定到种的水平，需要自己设计适合不同科属微生物特异性引物，且参比序列远远少于16SrRNA的序列，但基本涵盖了各属中常见重要种的序列信息。菌株经纯化、活化后，序列分析法鉴定需要6～48 h。质谱方法鉴定仅需6～8.5 min，且准确性高，对于临床上确诊病例进而有针对性明确治疗方案极为重要[19]，其缺点是设备价格昂贵。生理生化法是应用最久、最为广泛的经典微生物鉴定方法，虽然VITEK 2 COMPACT自动化仪器提高了鉴定效率并减少人为操作误差，但同种的不同菌株之间在很多生理生化指标上并不一致，这导致相当高的误判几率。虽然像FDA标准采用阳性率85%的形式提醒鉴定人员注意该种内菌株间在生理生化指标上存在的差异性，但是这让鉴定结果更难决断[20]。

3 结论

采用VITEK 2 COMPACT生理生化、MALDI-TOF-MS和rec A序列分析3种方法对13株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌疑似菌进行鉴定。结果表明，经VITEK 2 COMPACT生理生化鉴定鉴定后，8株菌株鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli），5株菌株鉴定为栖稻假单胞菌（Pseudomonasoryzihabitans）；经MALDI-TOF-MS与rec A序列分析鉴定，13株菌株均被鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（B.gladioli）。在13株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌疑似菌的鉴定方法中，MALDI-TOF-MS法和rec A序列分析法鉴定结果准确一致，而VITEK 2 COMPACT生化检测法存在缺陷，38%的菌株主要因D-山梨醇利用特性不同于典型株而被误判为栖稻假单胞菌。相比传统生化鉴定方法，MALDITOF-MS方法和rec A序列分析法在唐菖蒲伯克霍尔德氏菌鉴定中更为快速、准确。