应用离子色谱法检测牛栏山二锅头原酒中有机酸类物质

王 勇，魏金旺*

（北京顺鑫农业股份有限公司 牛栏山酒厂，北京 101301）

牛栏山酒厂地处北京市顺义区牛栏山镇，在酿造二锅头的工艺过程中，一直保持着制曲、立茬、发酵等一系列工序。牛栏山二锅头以高粱为酿酒原料，采用清香型低温大曲或麸曲为糖化发酵剂，低温入缸（池）的清蒸清茬地缸发酵，清蒸二次清和瓷砖池发酵，混蒸续茬老五甑工艺，发酵期为21～30d[1-4]。在质量上保持了传统的清香纯正、口味甘洌、酒体醇厚、酒力强劲的特点[5-6]，牛栏山二锅头酒作为我国清香型的典型代表性白酒之一，在国内外也具有较高的知名度，逐渐成为北京的一种城市名片[7-9]。牛栏山二锅头独特的风味特征由上百种风味物质共同作用形成，王勇等[10-11]采用浸入式固相微萃取、液液萃取结合气相色谱-质谱（gas chromatography-massspectrometer，GC-MS）联用技术对牛栏山二锅头的风味物质进行了定性研究，并采用保留指数法对定性结果进行了验证，共获得了101种香气化合物的确切定性结果，其中包括35种酯类、13种酸类、15种醇类、5种醛类、1种酮类、15种芳香族及酚类、5种呋喃类、2种吡嗪类、3种缩醛类、1种硫化物、6种其他类化合物；采用气相色谱-闻香-质谱（gaschromatography-olfactorymass spectrometry，GC-O-MS）联用仪方法解析了牛栏山二锅头中重要的香气组分特征，采用液液萃取法提取牛栏山二锅头白酒中的香气化合物，进行闻香分析GC-O和GC-MS分离鉴定，一次性检出92种香气化合物，其中对牛栏山二锅头白酒整体香气贡献大的香气成分有25种。但目前关于牛栏山二锅头中不挥发性风味物质的研究还很少有报道，“无酸不成味”，有机酸类物质是白酒的重要风味物质，白酒中有机酸的种类和含量对白酒的风味特征具有重要的影响，对白酒中有机酸种类、含量和生成规律的分析研究对于评价酒体质量、优化酿造工艺具有重要意义。

目前，饮料酒中有机酸的分析方法主要有分光光度法、反向高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法、气相色谱质谱（GC-MS）联用法、离子色谱（ion chromatography，IC）法等。其中离子色谱法因其灵敏度高、重复性好、操作简单成为饮料酒中有机酸分析广泛采用的方法。近年来，该方法开始应用于白酒中有机酸的分析检测。刘琼[12]选用浓香型白酒为样品，进行分析方法应用的探讨，并与气相色谱分析方法作对比。离子色谱法分析白酒样品中6～8个有机酸组分，只需约15 min，方法回收率98%～100%，重复实验的变异系数在5%以下。卜宇宏[13]运用离子交换分析方式加上抑制型电导检测，作出白酒中有机酸的特征图谱，结果表明乳酸、乙酸、丁酸、己酸的线性范围分别为15～35 mg/L、25～45 mg/L、5～25 mg/L、30～50 mg/L，4种有机酸样品加标回收率为98%～103%，说明该分析方法具有灵敏度高、分析速度快的特点。潘丙珍等[14]建立用离子色谱/电导检测法测定酒类中有机酸和无机阴离子的分析方法，对11种有机酸和5种无机阴离子具有良好的线性，相关系数在0.990 9～0.9997；准确度和精密度良好，样品加标回收率在81.0%～117.8%，相对标准偏差（relativestandaral deviation，RSD）＜5.0%；检出限低，在0.015～0.152mg/L。但是目前该方法还未见应用于清香型白酒原酒中有机酸类风味物质的分析检测。

本研究建立离子色谱法对清香型原酒中的有机酸进行检测，并着重分析研究了牛栏山二锅头原酒中的有机酸类物质，探明有机酸在不同原酒中的分布规律，对研究浓香型、酱香型等原酒中的有机酸提供理论研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

牛栏山二锅头原酒：北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂。分别选取大茬和二茬酒头、前段、中段、后段、尾段5个不同摘酒段，共十个酒样。

1.1.2 化学试剂

有机酸标准样品（甲酸钠、乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、丙酮酸钠、乳酸钠、琥珀酸钠、草酸钠、富马酸钠、柠檬酸钠、异丁酸、异戊酸、2-乙基丁酸、戊酸、己酸、山梨酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、乌头酸）：美国Sigma公司，母液均配制为1 000 mg/L，储存于2～8℃。所用溶液均用电阻率为18.2 MΩ·cm超纯水配制。

1.2 仪器与设备

ICS-3000型离子色谱仪（配有EG40淋洗液自动发生器、电导检测器和Chromeleon 6.80色谱工作站）、Ionpac AS11-HC型分离柱（250 mm×4 mm）、Ionpac AG11-HC型保护柱（50 mm×4 mm）、ASRS-ULTRA阴离子抑制器：美国Dionex公司；0.45μm过滤膜、Milli-QIQ 7000超纯水系统：美国Millipore公司；HGC-12A氮吹仪：重庆中谱科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 离子色谱条件

色谱柱：Ionpac AS11-HC型分离柱（250 mm×4 mm），Ionpac AG11-HC型保护柱（50 mm×4 mm）；柱温：30℃；流动相：EG自动产生淋洗液梯度淋洗，KOH梯度淋洗程序见表1；流速：1.0 mL/min；抑制器再生模式：外加水电抑制；电导检测器检测；进样量：25μL。首先选择单一有机酸进行检测，寻找其出峰时间及峰面积；其次选择混合标样进行检测。按照出峰时间进行有机酸的定性，使用离子色谱自主选择峰面积进行有机酸的定量。

表1 白酒有机酸分析KOH梯度淋洗程序Table 1 KOH gradient eluting procedure of organic acid in Baijiu analysis

1.3.2 样品前处理

将牛栏山二锅头酒样稀释50倍，过0.45μm过滤膜后直接进样，可直接定量浓度较高且保留时间靠前的部分有机酸（如乳酸、乙酸等）；将8 mL的酒样在30℃条件下氮吹至1 mL，用超纯水定容至2 mL，过0.45μm过滤膜后进样检测，即浓缩4倍进样检测，可以定量浓度较低且保留时间靠后的有机酸（如二元酸等）。

按照上述样品处理方式进行离子色谱检测，按照标准曲线回归方程计算样品中有机酸含量，回收率是通过离子色谱检测值与已知标样浓度的比值。

2 结果与分析

2.1 清香型白酒原酒中有机酸的检测方法的建立

根据离子色谱的检测，有机酸标准曲线回归方程、线性范围、检出限及回收率结果见表2，有机酸标准品离子色谱图见图1。

由表2可知，各有机酸测得的线性相关系数R2均在0.99以上，加标回收率除甲酸外（74.90%），在82%～118%之间。该方法具有操作简单、灵敏度高、检测有机酸种类多的特点，适合于清香型原酒中有机酸的分析检测。

由图1可知，该方法可在50 min内实现21种有机酸类的完全分离，并且在保证各种有机酸都能出峰的基础上，每个峰面都不重合，出峰时间能够完全分离开。因此，该检测方法能有效地检测清香型原酒中的有机酸，并且检测有机酸种类较多。

表2 21种有机酸离子色谱分析标准曲线回归方程、线性范围、检出限和回收率Table 2 Standard curves regression equation,linear range,detection limits and recovery rates of 21 organic acids analyzed by ion chromatography

图1 21种有机酸混合标准溶液离子色谱图Fig.1 Ion chromatography of 21 mixed standard solutions of organic acids

2.2 牛栏山二锅头原酒中有机酸种类及含量分析

采用1.3.2的处理原酒方法，对牛栏山二锅头原酒中有机酸种类和含量进行分析，结果见表3。由表3可知，在牛栏山原酒中共检出9种有机酸，主要包括乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸、己酸、丙酮酸。对不同原酒中有机酸定量分析发现，乙酸、乳酸是牛栏山原酒中的主要有机酸类物质，其中乙酸质量浓度范围为233.86～2416.98mg/L，占有机酸总含量的41.1%～79.3%；乳酸质量浓度范围为18.34～6504.96mg/L，占有机酸总含量的14.5%～57.5%；其他有机酸浓度较低，占有机酸总含量的1.3%～9.0%。乙酸和乳酸是牛栏山二锅头原酒中重要的风味物质，适量的乙酸和乳酸可赋予酒体酸爽感和协调感，平衡酒的苦味，提高酒的后味，同时有利于储存过程中酒体老熟。

表3 牛栏山二锅头原酒中有机酸含量测定结果Table 3 Determination results of organic acids contents in base liquor of Niulanshan Erguotou mg/L

2.3 牛栏山二锅头原酒中有机酸分布规律分析

清蒸二次清工艺可分为大茬酒和二茬酒，其中大茬酒采用纯粮发酵，高粱经过破碎、润料、蒸煮糊化、冷散、加曲后入缸发酵30 d，上甑分段掐酒得大茬酒；大茬蒸馏后的酒醅重新加水、冷散、加曲后二次入缸发酵30 d，上甑分段掐酒得二茬酒。从表3中可以看出，原酒中的有机酸中乙酸和乳酸含量占绝对优势，因此本研究着重对其两个指标进行了分析，乙酸变化分析结果见图2。

图2 不同茬次原酒中乙酸含量比较Fig.2 Comparison of acetic acids contents in different batch of base liquor

由图2可知，大茬酒和二茬酒在不同摘酒时间段乙酸含量的变化趋势有差别，随着摘酒时间的推移，大茬、二茬乙酸含量呈平缓上升曲线，乙酸在尾段含量最高。在牛栏山原酒酒头中的乙酸为300 mg/L左右，而在后段、尾段则提高了3倍左右。原因可能是乙酸沸点较高（117.9℃），本身难蒸馏出，但酒中含有较多的醇、酯和醛类物质，乙酸与这些低沸点的化合物（乙醇为78.4℃）和水形成一定的共沸和拖带作用，在一定程度上降低了乙酸的沸点，使得乙酸也能随着温度升高而逐渐馏出。

原酒中的乳酸变化分析结果见图3。

图3 不同茬次原酒中乳酸含量比较Fig.3 Comparison of lactic acid contents in different batch of base liquor

由图3可知，大茬乳酸几乎呈线性递增，尾段酒的酸增有一个突跃；二茬酒的乳酸增加呈平缓上升曲线。在牛栏山原酒中酒头的乳酸为60 mg/L左右，而在后段、尾段则提高了5倍左右。这主要是因为难挥发酸在温度较低的时候难以蒸馏出[15-16]，所以越是难挥发的物质越是集中在温度较高的后期馏出，这也解释了随着摘酒时间的推移，难挥发的乳酸增大的现象。

3 结论

本研究采用离子色谱技术建立了清香型白酒原酒中21种有机酸含量的分析方法。该方法标准曲线线性相关系数R2＞0.99，灵敏度高，所测样品浓度在线性范围之内，适合于白酒原酒中有机酸的分析检测。采用该方法系统分析了不同类别牛栏山原酒中有机酸的种类、含量和分布规律。在牛栏山原酒中共检出9种有机酸，主体酸类物质为乙酸和乳酸。从定量结果来看，乙酸、乳酸质量浓度在有机酸中属于主要酸类物质，乙酸含量为233.86～2416.98mg/L，占有机酸总量的41.1%～79.3%；乳酸含量为18.34～6 504.96 mg/L，占有机酸总量的14.5%～57.5%；其他有机酸含量较低，占有机酸总量的1.3%～9.0%。

进一步分析乙酸和乳酸在不同原酒中的分布规律发现，大茬酒和二茬酒在不同摘酒时间段乙酸含量的变化趋势有差别，随着摘酒时间的推移，乙酸大二茬含量呈平缓上升曲线。而大茬酒的乳酸几乎呈线性递增，尾段酒的酸增有一个突跃；二茬酒的乳酸增加呈平缓上升曲线，这主要是由乙酸和乳酸结构决定的。