HPLC测定胃康宁颗粒中5种指标成分含量

郭琳 倪健 杜梓萱 张海英 尹兴斌

摘要：目的 建立胃康宁颗粒中指标成分表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和黄芩苷的含量测定方法，为胃康宁颗粒的质量控制提供依据。方法 采用HPLC，色谱柱Agilent Eclipse Plus C18为（4.6 mm× 250 mm，5 ?m）。黄连生物碱流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（50∶50，每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0），检测波长为345 nm；黄芩苷流动相为乙腈-0.2%磷酸（21∶79），检测波长为280 nm。结果 黄连生物碱及黄芩苷测定均无阴性干扰，表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱及黄芩苷的进样量分别在0.005 26～0.211 ?g（r=0.999 6）、0.005 37～0.215 ?g（r=1）、0.005 55～0.222 ?g（r=1）、0.028 06～1.123 ?g（r=1）、0.096 5～1.930 ?g（r=0.999 8）范围内线性关系良好，精密度、稳定性均良好，平均回收率分别为97.63%（RSD=2.32%）、99.05%（RSD=2.21%）、97.66%（RSD=1.94%）、101.50%（RSD=1.92%）、100.31%（RSD=1.12%）。结论 本方法准确、稳定、重复性好，可用于胃康宁颗粒中表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和黄芩苷的含量测定。

关键词：胃康宁颗粒；表小檗碱；黄连碱；盐酸巴马汀；盐酸小檗碱；黄芩苷；含量测定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.020

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）12-0083-05

Abstract： Objective To establish an HPLC method for content determination of epiberberine， coptisine， palmatine， berberine and baicalin； To provide the basis for the quality control standard of Weikangning Granules. Methods Agilent Eclipse Plus C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m） was used. For rhizoma coptidis alkaloids， mobile phase was acetonitrile - 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution （50：50， 0.4 g sodium dodecyl sulfate was added in each 100 mL， to adjust the pH 4.0 with phosphoric acid）， and detection wavelength was 345 nm； For baicalin， mobile phase was acetonitrile - 0.2% phosphoric acid solution （21：79）， and detection wavelength was 280 nm. Results No negative interference was found in determination of rhizoma coptidis alkaloids and baicalin. Epiberberine， coptisine， palmatine， berberine and baicalin showed good liner relationship in the range of 0.005 26– 0.211 ?g （r=0.999 6）， 0.005 37–0.215 ?g （r=1）， 0.005 55–0.222 ?g （r=1）， 0.028 06–1.123 ?g （r=1）， 0.096 5–1.930 ?g （r=0.999 8）； degree of precision of instrument and the stability of samples were good. The average recovery rates were 97.63% （RSD=2.32%）， 99.05% （RSD=2.21%）， 97.66% （RSD=1.94%）， 101.50% （RSD=1.92%） and 100.31% （RSD=1.12%）， respectively. Conclusion The method is accurate， stable and reproducible. It can be used for the content determination of epiberberine， coptisine， palmatine， berberine and baicalin of Weikangning Granules.

Keywords： Weikangning Granules； epiberberine； coptisine； palmatine； berberine； baicalin； content determination

胃康寧方是中国中医科学院望京医院的临床经验方，由黄连、黄芩等组成，具有消痞散结、益气养阴、活血解毒等功效，用于治疗寒热互结、气阴不足、毒瘀互阻所致的慢性萎缩性胃炎。经长期临床验证，疗效确切，且无毒副作用。该方长期以汤剂形式应用于临床，患者服用、贮存、携带很不方便。为方便患者使用而制成颗粒。黄连为方中君药，主要含有生物碱类成分，包括表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀及盐酸小檗碱等，现代药理研究表明，黄连生物碱具有明显的抗炎作用以及胃黏膜的保护作用，其中小檗碱对于免疫系统具有较强的调节作用[1-3]。黄芩为方中臣药，主要含有黄酮类成分，包括黄芩苷、黄芩素等。现代药理研究表明，黄芩苷抗炎作用较强，可显著影响白细胞的多种功能，如抑制白细胞内白三烯B4、白三烯C4的生物合成，抑制趋化肽（fMLP）激发的白细胞内Ca2+升高，并促进内环磷腺苷水平提高[4]。为了更好地控制胃康宁颗粒质量，本研究建立测定该制剂指标成分表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和黄芩苷含量的方法。

1 仪器与试药

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津，SPD-M20A PDA检测器），BT125D分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HH-4型恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

黄连碱（批号112026-201601，纯度95.1%）、盐酸巴马汀（批号110732-201611，纯度86.8%）、盐酸小檗碱（批号110713-201212，纯度86.7%）及黄芩苷（批号110715-201619，纯度93.5%），中国食品药品检定研究院；表小檗碱对照品（纯度98.0%，批号W06M8Z30708），上海源叶生物科技有限公司；水为纯净水，娃哈哈集团有限公司；乙腈为色谱纯，美国Fisher公司；甲醇、磷酸为分析纯，北京化工厂。胃康宁颗粒（批号20171001、20180101，中日友好医院制剂室制备；批号20171201，北京中医药大学中试车间制备），黄连阴性颗粒（批号20171101，自制），黄芩阴性颗粒（批号20171102，自制）。

2 方法与结果

2.1 黄连生物碱含量测定

2.1.1 色谱条件

采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 ?m），流动相为乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（50∶50，每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0），流速0.8 mL/min，检测波长345 nm，柱温30 ℃，进样量10 ?L。

2.1.2 供试品溶液的制备

取本品0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率100 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备

取表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱0.021 05、0.021 49、0.022 19、0.112 3 mg的混合对照品溶液，摇匀，备用。

2.1.4 阴性对照溶液的制备

取等量黄连阴性颗粒，按“2.1.2”项下方法制成黄连阴性对照溶液。

2.1.5 专属性试验

精密吸取陰性对照溶液、对照品溶液及供试品溶液各10 ?L，分别测定，结果阴性对照在相同保留时间处未见干扰，说明该方法专属性强。色谱图见图1。

2.1.6 线性关系考察

精密量取混合对照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 mL分别置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得系列对照品溶液。取系列对照品溶液及混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样检测。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，进行线性回归，结果见表1。黄连生物碱在各自浓度范围内呈良好线性关系。

2.1.7 精密度试验

精密吸取各黄连生物碱对照品溶液10 ?L，注入高效液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，结果表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱RSD分别为0.46%、0.22%、0.45%、0.28%，表明仪器精密度良好。

2.1.8 重复性试验

取同一批样品（批号20171001）约0.2 g，精密称定，共6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量，结果4种黄连生物碱含量RSD分别为0.85%、0.72%、0.63%、0.67%，表明本方法重复性良好。

2.1.9 稳定性试验

取制备好的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定，结果表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量RSD分别为0.72%、0.59%、0.60%、0.52%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。

2.1.10 加样回收率试验

取同一批已知黄连生物碱含量的胃康宁颗粒样品（批号20171001）0.1 g，精密称定，共6份，分别精密加入混合对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样检测，计算回收率，结果见表2～表5。

2.2 黄芩苷含量测定

2.2.1 色谱条件

采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 ?m），流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（21∶79），流速1.0 mL/min，检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 ?L。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品0.1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流60 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 对照品溶液的制备

取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含黄芩苷0.193 0 mg的对照品溶液，摇匀，作为对照品贮备液，备用。

2.2.4 阴性对照溶液的制备

取等量黄芩阴性颗粒，按“2.2.2”项下方法制成黄芩阴性对照溶液。

2.2.5 专属性试验

精密吸取阴性对照溶液、对照品溶液及供试品溶液各10 ?L，分别测定，结果阴性对照在相同保留时间处未见干扰，说明该方法专属性强。色谱图见图2。

2.2.6 线性关系考察

精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.5、5.0 mL分别置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得系列对照品溶液。取系列对照品溶液及对照品贮备液，按“2.2.1”项下色谱条件进样检测。以黄芩苷峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=3 167 412X-200 460（r=0.999 8），表明黄芩苷进样量在0.096 5～1.930 ?g范围内线性关系良好。

2.2.7 精密度试验

精密吸取黄芩苷对照品溶液10 ?L，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算RSD，结果RSD=0.51%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验

取同一批样品（批号20180101），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，测定黄芩苷含量，计算RSD，结果RSD=1.97%，表明本方法重复性良好。

2.2.9 稳定性试验

取制备好的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h测定，结果黄芩苷含量的RSD=0.30%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定性良好。

2.2.10 加样回收率试验

取同一批已知黄芩苷含量的胃康宁颗粒样品，精密称定6份，分别精密加入黄芩苷对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件下进样检测，计算回收率，结果见表6。

2.3 样品含量测定

取3批样品，按上述方法制备供试品溶液并测定黄连生物碱和黄芩苷含量，结果见表7。根据所得结果，将胃康宁颗粒中表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱及黄芩苷最低含量限度分别暂定为0.70、0.92、1.31、4.82、8.78 mg/g。

3 讨论

本研究建立了胃康宁颗粒中表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和黄芩苷的含量测定方法，专属性、精密度、重复性、稳定性、准确性均符合2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则的规定，能够准确测定5种指标成分的含量，为胃康宁颗粒的质量控制提供含量测定方法。

目前，黄连在复方中的应用非常多，由于表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀较盐酸小檗碱含量低，因此大多数研究仅控制盐酸小檗碱含量，忽略了前3种生物碱，而这3种生物碱的药效作用不容忽视，同时测定4种生物碱的含量能更全面控制复方的质量，保证疗效的稳定性。采用HPLC测定生物碱，拖尾因子容易偏大，造成峰形不对称，影响含量测定的准确性。本研究的测定方法分离度好，峰形对称，能够准确定量。黄芩常与黄连配伍使用，由于测定生物碱的色谱条件特殊，需调节流动相的pH值并添加一些表面活性剂来保证峰形对称，而采用普通C18色谱柱虽能在一些色谱条件下同时测定此5种成分，但难以保证其定量的准确性。本研究建立的测定方法可准确测定这5种药效成分。

在黄连生物碱含量测定中，供试品溶液的制备考察了水、甲醇、甲醇-盐酸（100∶1）等提取溶剂，分别考察了超声及加热回流30、60、90 min的提取效果，结果表明，采用甲醇为溶剂，超声处理30 min，黄连生物碱的提取效果最佳。

由于黄连生物碱峰形拖尾严重，所以考察了4种色谱柱（Agilent Zorbax SB-C18、Agilent Eclipse Plus C18、Merck Rp-C18、Waters Sunfire C18）对黄连生物碱的分离效果，流动相考察了乙腈-0.2%磷酸等度不同比例、乙腈-0.2%磷酸梯度、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（20∶80）及乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（50∶50，每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0）等[5-6]，流速考察了0.8、1.0、1.2 mL/min，结果表明，采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱、以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（50∶50，每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0）为流动相、流速为0.8 mL/min时，黄连生物碱无杂质干扰，分离度良好，峰形对称。

在黄芩苷含量测定中，供试品溶液的制备考察了水、甲醇等提取溶剂，以及不同的溶剂倍量和超声、加热回流30、60、90 min的提取效果，结果表明，采用甲醇为溶剂，加热回流提取60 min，黄芩苷的提取效果最佳。

色谱条件考察了甲醇水、乙腈水、甲醇-0.2%磷酸（42∶58、40∶60）和乙腈-0.2%磷酸（21∶79、25∶75、30∶70）[7-8]等流动相及0.8、1.0、1.2 mL/min不同流速，结果表明采用乙腈-0.2%磷酸（21∶79）为流动相、流速为1.0 mL/min时，黄芩苷的保留时间适中，阴性对照无干扰，分离度良好，峰形对称。

本试验测得胃康宁颗粒样品中表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和黄芩苷的平均含量分别为1.01、1.33、1.88、6.89、12.55 mg/g。考虑到大生产时中药材受采收季节、产地、贮存环境及时间的影响，因此将胃康宁颗粒中5種成分最低含量限度暂定为0.70、0.92、1.31、4.82、8.78 mg/g。

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