扶正解毒化瘀方总苷提取物对呼吸道合胞病毒感染宿主细胞炎性反应的影响

程淼 王明哲 宋金华 董晓旭 杨春静 王成祥

摘要：目的 觀察扶正解毒化瘀方总苷提取物对呼吸道合胞病毒（RSV）感染HEp-2细胞Toll样受体（TLRs）相关细胞炎性因子的影响，探讨其可能的作用机制。方法 建立RSV感染HEp-2细胞模型，随机分为病毒对照组、总苷提取物组及利巴韦林组，各给药组给予相应药物，同时以未感染RSV的HEp-2细胞作为空白对照。应用液相色谱-质谱分析扶正解毒化瘀方全方、总苷提取物及其药物血清的主要成分。采用ELISA检测细胞上清液白细胞介素（IL）-1β、IL-8、干扰素-α（IFN-α）、TLR3、TLR7水平。结果 扶正解毒化瘀方全方提取物共鉴别出10个化学成分，以苷类为主。扶正解毒化瘀方总苷提取物共鉴别出9个化学成分，其中入血成分共鉴别出8个化学成分，包括芍药苷、木犀草素、野黄芩苷、连翘酯苷H、异荭草苷、连翘苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re。与HEp-2细胞组比较，病毒对照组感染后24、48、72 h IFN-α、IL-1β、IL-8、TLR3和TLR7水平均升高；与病毒对照组比较，总苷提取物组感染后24、48、72 h IFN-α、IL-1β、IL-8、TLR3和TLR7水平均降低。结论 扶正解毒化瘀方总苷提取物可能通过调节TLRs相关细胞炎性因子，抑制细胞炎性反应起到治疗RSV肺炎的作用。

关键词：呼吸道合胞病毒；扶正解毒化瘀方总苷提取物；液相色谱-质谱分析；Toll样受体；细胞因子；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.010

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）12-0035-05

Abstract： Objective To observe the effects of total glycoside extracts of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on related cytokines in HEp-2 cells infected by respiratory syncytial virus （RSV）； To discuss the possible mechanism of action. Methods RSV infection HEp-2 cell model was established and randomly divided into virus control group， total glycoside extracts group and Ribavirin group. Each administration group was given relevant medicine， and at the same time， HEp-2 cells not infected with RSV were set as blank controls. The main components of prescription， total glycosides extracts and serum of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry. The levels of IL-1β， IL-8， IFN-α， TLR3 and TLR7 in cell supernatant were detected by ELISA.Results Totally 10 chemical constituents were identified from total extracts of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction， while glycoside as the most common component. 9 chemical constituents were identified from the total glucoside extracts of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction， while paeoniflorin， luteolin， scutellarin， forsythoside H， isopolygonarin， forsythin， ginsenoside Rb1 and ginsenoside Re were identified in the composition of the blood. Compared with HEp-2 cell group， IL-1β， IFN-α， TLR3 and TLR7 increased in the virus control model group when the HEp-2 cell group was infected after 24， 48 and 72 h. Compared with virus control group， IL-1β， IFN-α， TLR3 and TLR7 were reduced in different degrees in total glycoside extracts group when total glycoside extracts group was infected after 24， 48 and 72 h. Conclusion Total glycoside extracts of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction may play a role in the treatment of RSV pneumonia by regulating TLRs-associated cytokines and inhibiting cellular inflammatory responses.

Keywords： RSV； total glucoside extracts of Fuzheng Jiedu Huayu Decotion； liquid chromatography-mass spectrometry analysis； Toll-like receptor； cytokine； rats

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是一种RNA病毒，分布广且有传染性，可致肺炎，是引起婴幼儿、老年人及免疫缺陷者下呼吸道感染的重要病原之一。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是近来发现并广泛研究的一类先天性免疫受体家族，是免疫系统抵抗病原微生物感染的天然受体。TLRs通过识別细菌、病毒等不同病原相关分子模式，在启动先天性免疫反应中起着核心作用，也能调节获得性免疫。RSV感染时，其致病性与破坏气道上皮细胞有关，更与其感染后引发的机体免疫反应有关。目前缺乏专属性强的治疗RSV药物，且尚无美国食品药品管理局批准用于预防RSV的疫苗。前期课题研究显示，扶正解毒化瘀方对多种病原体所致肺炎有较好疗效[1]，但作用机制尚不清楚。扶正解毒化瘀方由黄芩、连翘、漏芦等组成，其化学成分包括黄芩苷、连翘苷、人参皂苷、败酱草苷、芍药苷等，苷类化合物在该方中所占比例较大。本实验采用液相色谱-质谱法对扶正解毒化瘀方全方和总苷提取物入血成分进行分析，并对该方总苷提取物抗RSV的作用机制进行初步研究。

1 实验材料

1.1 动物

SD雄性大鼠60只，SPF级，体质量（200±10）g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于中国中医科学院中药研究所实验动物房。

1.2 病毒和细胞株

RSV-A型、人喉癌细胞（HEp-2），中国疾病控制中心病毒病预防控制所提供。

1.3 药物

扶正解毒化瘀方（西洋参6 g，黄芩15 g，连翘15 g，漏芦15 g，败酱草30 g，瓜蒌30 g，赤芍15 g，薏苡仁30 g），饮片由北京中医药大学东直门医院中药房提供，符合2015年版《中华人民共和国药典》质量控制标准。利巴韦林注射液，天津药业焦作有限公司，每支100 mg/mL，批号10092411。

1.4 主要试剂与仪器

鼠TLR-3、TLR-7、干扰素-α（IFN-α）Blue Gene（欣博盛生物科技有限公司），鼠IL-1β、IL-8 Blue Gene（联科生物技术有限公司）。CO2培养箱（美国Thermo），恒温水浴箱（北京长风），ⅡB级生物安全柜SCV1303EO（日本HITACHI），HC-3018R高速冷冻离心机（中科中佳公司），全自动多功能酶标仪（美国Thermo），电热恒温培养箱（天津泰斯特仪器有限公司），高分辨串联质谱仪（美国Thermo），XP26型电子天平（METTLER TOLEDO），3K15型冷冻高速离心机（Sigma），移液枪（Gilson），XW-80A涡旋仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）。

2 实验方法

2.1 药物和药物血清制备

扶正解毒化瘀方提取物制备：参考药物临床用药方式，采取全方水煎煮制备工艺。全方饮片按量称取后，置提取罐中，加10倍量水煎煮2次，每次1.5 h，过滤，收集滤液，减压浓缩，干燥，粉碎，即得。全方提取物粉末每克相当于原药材4.2 g，根据实验所需剂量，用蒸馏水配制成浓度为0.28 g/mL药液。扶正解毒化瘀方总苷提取物制备：参考药物临床用药方式和药物成分性质，采取全方水煮醇沉制备工艺。全方饮片按量称取后，置提取罐中，加10倍量水煎煮2次，每次1.5 h，过滤，收集滤液，减压浓缩至相对密度1.10～1.15（60 ℃），缓慢加入乙醇至含醇量60%，冷置12 h，过滤，收集滤液，减压浓缩，减压干燥，粉碎，即得。总苷提取物每克相当于原药材6.5 g，根据实验所需剂量，用蒸馏水配制成浓度为0.18 g/mL药液。药物血清制备：取SD大鼠，雌雄各半，适应性喂养1周，分为空白对照组、全方提取物组和总苷提取物组，每组10只。全方提取物和总苷提取物终浓度分别为0.75、0.48 g/mL，按人与大鼠体表面积换算公式计算灌胃量，按1 mL/100 g灌胃，空白对照组予等量生理盐水灌胃，连续3 d，大鼠末次灌胃给药2 h后取血，37 ℃水浴，2000 r/min离心5 min，分离血清，以0.22 μm无菌滤器过滤，置于-20 ℃冰箱保存，临用以DMEM培养液配制。

2.2 病毒滴定

参照文献[2]方法进行病毒培养和滴定，按Karber公式计算RSV对HEp-2细胞TCID50滴度，实验所用RSV病毒滴度为10-4 TCID50/0.1 mL。

2.3 HEp-2细胞毒性检测

细胞培养和实验药物（扶正解毒化瘀方总苷提取物和利巴韦林）对HEp-2细胞毒性实验具体操作参考文献[3]，确定扶正解毒化瘀方总苷提取物和利巴韦林最大无毒剂量分别为0.509 mg/mL和0.078 mg/mL。

2.4 分组及给药

将HEp-2细胞接种于1 mL细胞培养管，培养至单层，弃掉培养液，分为HEp-2细胞组、病毒对照组、总苷提取物组及利巴韦林组。除HEp-2细胞对照组外其他3组加入100 TCID50 RSV稀释液，37 ℃、5%CO2吸附1 h，弃掉病毒液，给药组分别加入0.509 mg/mL扶正解毒化瘀方总苷提取物和0.078 mg/mL利巴韦林，每管200 mL，37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h。

2.5 液相色谱-质谱分析

精密称取总苷提取物及有效部位干膏各10 mg，分别置1.5 mL离心管中，加入10%甲醇1 mL，超声使药物完全溶解，制得总苷提取物及有效部位浓度均为10 mg/mL，取适量，过0.25 μm针孔滤器，注入液相瓶，进样10 μL，进行LC-MS/MS测定，平行3份。

精密吸取给药前后血浆样品100 μL，加乙腈沉淀蛋白1 mL，涡旋3 min，14 000 r/min离心20 min，移取有机层，氮气吹干，残渣加100 μL甲醇复溶，涡旋2 min，14 000 r/min离心10 min，取上清液置于液相瓶，进样10 μL，行LC-MS/MS测定，平行3份。

色谱条件：采用ACQUITY UPLCTM BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.2 mL/min；进样量：10 μL；流动相：0.1%甲酸水-甲醇；运行时间：0～45 min；分辨率：70 000；最大离子注入时间：150 ms；扫描范围：100～1500 m/z阴性。

2.6 细胞炎性因子检测

采用ELISA檢测各实验组细胞上清液炎性因子IL-1β、IL-8、IFN-α、TLR3、TLR7的表达。严格按试剂盒说明书进行操作。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 液相色谱-质谱分析结果

扶正解毒化瘀方全方提取物共鉴别出10个化学成分，分别为槲皮素、芍药苷、木犀草素、野黄芩苷、连翘酯苷H、异荭草苷、连翘苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re。扶正解毒化瘀方总苷提取物共鉴别出9个化学成分，分别为芍药苷、木犀草素、野黄芩苷、连翘酯苷H、异荭草苷、连翘苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re。扶正解毒化瘀方全方提取物入血成分共鉴别出3个化学成分，分别为芍药苷、连翘酯苷H、人参皂苷Rb1。扶正解毒化瘀方总苷提取物入血成分共鉴别出8个化学成分，芍药苷、木犀草素、野黄芩苷、连翘酯苷H、异荭草苷、连翘苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re。结果见图1～图5。

4.2 扶正解毒化瘀方总苷提取物对呼吸道合胞病毒感染细胞上清液干扰素-α水平的影响

与HEp-2细胞组比较，病毒对照组RSV感染后24、72 h IFN-α水平均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与病毒对照组比较，总苷提取物组RSV感染后24、48、72 h IFN-α均有所升高，其中RSV感染后48 h差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

4.3 扶正解毒化瘀方总苷提取物对呼吸道合胞病毒感染细胞上清液白细胞介素-1β水平的影响

与HEp-2细胞组比较，病毒对照组RSV感染后24、48、72 h IL-1β均有所升高，其中RSV感染后24、48 h差异有统计学意义（P<0.05）；与病毒对照组比较，总苷提取物组RSV感染后24、48、72 h IL-1β均有所降低，其中RSV感染后24、48 h差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

4.4 扶正解毒化瘀方总苷提取物对呼吸道合胞病毒感染细胞上清液白细胞介素-8的影响

与HEp-2细胞组比较，病毒对照组RSV感染后24、48、72 h IL-8均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与病毒对照组比较，总苷提取物组RSV感染后24、48、72 h IL-8均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3。

4.5 扶正解毒化瘀方总苷提取物对呼吸道合胞病毒感染细胞上清液Toll样受体3、7水平的影响

与HEp-2细胞组比较，病毒对照组RSV感染后24、48、72 h TLR3和TLR7水平均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与病毒对照组比较，总苷提取物组RSV感染后24、48、72 h TLR3和TLR7水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表4、表5。

5 讨论

RSV感染是除流感病毒之外最常见的病原体，RSV所致肺炎病情更为严重，但在临床诊断上容易被忽视。RSV感染能诱导气道上皮细胞产生多种细胞炎性因子，如IL-6、IL-8等[4]，引起细支气管炎、肺炎等。TLRs单个跨膜非催化性蛋白质可识别来源于微生物具有保守结构的分子，参与非特异性免疫，同时也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。当微生物突破机体的物理屏障，TLR可识别它们并激活机体产生免疫应答[5]。TLR3是识别病毒dsRNA的受体，在抗病毒、阻止病毒复制，保护机体中起重要作用[6]，TLR7识别RSV的负链RNA病毒后能介导天然抗病毒反应[7]。先天性免疫是宿主防御病毒感染的第一道天然防线，抗病毒先天性免疫关键是机体合成和分泌Ⅰ型干扰素，包括IFN-α和IFN-β。IFN-α/β属Ⅰ型干扰素，是发挥早期抗病毒和免疫刺激活性的主要效应分子。细胞抗病毒先天免疫包含宿主模式识别受体，该模式识别入侵病毒并启动一系列信号事件致Ⅰ型干扰素和促炎细胞因子的产生[8-9]。

清热解毒为温热病之主要治法，且强调尽早使用，“邪既入，即以逐秽为第一要务”，针对热毒炽盛、毒瘀互结、正气亏虚的核心病机，采用“风淫于内，治以辛凉，佐以苦甘”的治则拟定扶正解毒化瘀方药。本实验结果显示，与HEp-2细胞组比较，病毒对照组RSV感染后24、48、72 h IFN-α、IL-1β、IL-8、TLR3和TLR7水平均升高；与病毒对照组比较，总苷提取物组RSV感染后24、48、72 h IFN-α、IL-1β、IL-8、TLR3和TLR7水平均降低。综上，扶正解毒化瘀方总苷提取物可能通过调节TLRs相关细胞炎性因子，抑制细胞炎性反应，而起到治疗RSV肺炎的作用。

参考文献：

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