PCR-DGGE技术在城镇供排水系统微生物多样性研究中的应用

贾淑宇，张克峰，逯南南，王明泉，赵清华,孙韶华，贾瑞宝

(1.山东建筑大学市政与环境工程学院，山东 济南 250101；2.山东省城市供排水水质监测中心，山东 济南 250013)

目前微生物多样性是微生物生态学的主要研究内容之一，通过研究微生物多样性从而将微观的微生物群落结构与宏观的生态系统功能之间紧密相连。在自然环境中，仅有0.1% ～1%的微生物可以通过常规培养方法进行检测与分离[1]，大量的微生物以活的非可培养状态的形式存在，如霍乱弧菌、产毒素大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎杆菌、宋内志贺氏菌、创伤弧菌、副溶血性弧菌等[2]，这些非可培养状态的微生物对人类健康构成了潜在的威胁。

应用分子生物学技术是目前微生物研究的一种趋势，随着分子生物学技术的发展，越来越多的技术广泛运用于微生物的鉴定中，其中变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)技术是检测微生物多样性的技术手段之一。Fischer等[3]最早利用DGGE技术检测DNA片段中的点突变；Muyzer等[4]第一次利用DGGE技术分析了复杂微生物种群遗传的多样性，之后该技术被广泛应用于研究水体、土壤[5]、活性污泥、沉积物[6-7]等环境样品中微生物群落结构的多样性及其动态变化，包括细菌、真菌、藻类和真核原生生物群落[8-10]等；近几年DGGE技术也常用于研究微生物能源的开发[11]。

基于上述研究，本文概述了聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(Ploymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,PCR-DGGE)技术的原理和特点，通过对水体微生物相关研究成果的系统分析，总结并归纳了PCR-DGGE技术在城镇供水系统和污水处理系统中微生物多样性分析等方面的研究进展和应用成效，为该技术在水环境中微生物多样性的研究提供理论依据。

1 PCR-DGGE技术的原理和特点

1.1 PCR-DGGE技术的原理

普通凝胶电泳无法分开长度相同但序列不同的DNA片段，变性梯度凝胶电泳(DGGE)是在聚丙烯酰胺凝胶中加入线性梯度的尿素和甲酰胺作为变性剂，以区分长度相等但序列不同的DNA分子。电泳时随着变性剂浓度的升高， DNA双链序列迁移到变性凝胶一定位置并达到其解链温度时便开始部分解链，DNA双链末端一旦开始解链，其在凝胶中的电泳速度将大幅度下降。长度相同但序列不同的DNA片段的解链区域及解链温度都不同，它们在凝胶中不同位置发生部分解链而导致迁移速率大大下降，泳动受阻的DNA片段在不同位置停留，从而达到分离不同序列DNA片段的目的。

序列不同的DNA片段最终以电泳图像展现出来，采用Quantity One 分析软件通过对电泳条带进行定量分析，分析结果可作为微生物多样性统计的基础数据。通常以Shannon-Weiner(H)指数来反映群落中微生物的种类，群落中微生物的种类增多代表群落的复杂程度增加，即H值愈大，表明群落中所含微生物的种类越多；以Pielou’s均匀度指数(E)估计该群落物种分布的均匀度[12]。具体计算公式如下：

(1)

E=H/lnS

(2)

式中:pi表示第i个种群的相对多度,pi=ni/N(其中ni为第i个种群的个体数；N为群落中所有种群的个体总数)；S表示物种的丰度，即样本中含有的物种总数。

PCR-DGGE技术的操作过程复杂(见图1)，每个环节皆有可能影响研究结果，众多研究者在减少干扰、提高方法准确度等方面做了大量的工作。如吴敏娜等[13]研究发现采用异硫氰酸胍(Guandine Thiocyanate,GITC)法提取DNA可获得较高的浓度和纯度，是一种较为理想的DNA提取方法。在进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增时，由于靶基因扩增几率不同，会造成扩增偏差，Korbie等[14]证明采用降落PCR技术可提高PCR扩增的特异性和灵敏度，使用多种引物同时分析亦可减少扩增偏差。DGGE技术通常使用溴化乙啶(Ethidium Bromide,EB)作凝胶染色剂，其操作简单，但它是一种具有高诱变性的化学物质，且灵敏度较低，染色后背景荧光信号较高；Gel Red和Gel Green 是近年来新兴的两种安全稳定的荧光核酸凝胶染色剂，无论是用于预制凝胶染色还是凝胶电泳后染色，都具有极高的灵敏度。

图1 PCR-DGGE技术的基本操作流程Fig.1 Flow chart of the basic operation of PCR- DGGE technology

1.2 PCR-DGGE技术的特点

基于研究的技术类型，一般将微生物多样性研究方法分为两大类：传统生物化学方法和现代分子生物学技术。传统生物化学方法包括异养菌平板计数法(Heterotrophic Plate Counts,HPC)、光学显微镜分析、Biolog微平板分析、磷脂脂肪酸(Phospholipid Fatty Acid，PLFA)谱图分析、脂肪酸甲酯(Fatty Acid Methyl Esters，FAME)谱图分析等，这些方法适用范围与精度各不相同，各有其优缺点：非可培养微生物影响HPC结果的准确性；部分细胞形态学差异不明显，很难在光学显微镜下区分，且缺乏细胞壁的微生物固定后很容易变形，更难在显微镜下进行分类鉴定；Biolog微平板分析能够进行95种唯一碳源的生化反应测试，灵敏度高，但精度一般；PLFA和FAME谱图分析可以定量描述微生物群落的动态变化，但针对特异微生物类群的鉴定还不够准确。现代分子生物学技术从基因层面研究微生物的多样性，如核酸探针、生物芯片、双向电泳、荧光定量PCR技术等，这些技术可以对某一特定微生物种类进行定性鉴定，甚至还可做定量分析，但它们不能对环境中共存的其他微生物进行鉴定。

PCR-DGGE技术有效解决了上述问题，能够快速、全面、准确地获得样品中微生物的信息，较传统生物化学方法具有明显的优势，被越来越多的微生物研究学者所推崇，但该技术也存在一些弊端，其优缺点详见表1。

表1 PCR-DGGE技术的优缺点

从最初用于检测点突变到分析微生物多样性及其动态变化，PCR-DGGE技术不断得到改进，已衍生出温度梯度凝胶电泳(Temperature Gradient Gel Electrophoresis,TGGE)、瞬时温度梯度电泳(Transient Temperature Gradient Electrophoresis,TTGE)和恒定变性凝胶电泳(Constant Denatured Gel Electrophoresis,CDGE)等技术，使其操作方法不断优化且结果准确性有所提高，而在DGGE技术基础上发展的双梯度DGGE(Double-Gradient Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DG-DGGE)[15-16]技术、依赖培养的DGGE(Culture-Dependent Gradient Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,CD-DGGE)[17]技术等，使DNA片段条带展现得更加清晰、全面，同时DGGE技术结合荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)[18]技术、微电极测量技术[19]等方法进行综合分析，克服了PCR-DGGE技术的弊端，可为更详细、准确地分析微生物群落的复杂性服务，这些都将使PCR-DGGE技术在分子生物学研究中发挥着愈来愈重要的作用。

2 PCR-DGGE技术的应用

随着PCR-DGGE技术体系的日益成熟，已被越来越多地应用于水环境中微生物多样性的检测，尤其在城镇供水系统和污水处理系统中微生物多样性检测方面的大量应用，将有助于了解其微生物群落结构，对保护生态环境及人类健康具有重大的意义。

2.1 PCR-DGGE技术在城镇供水系统中的应用

众多学者利用PCR-DGGE技术对城镇供水系统中微生物多样性和群落结构进行了鉴定(见表2)，以表征城镇供水系统中微生物群落结构的稳定性，为水源水质稳定性监控、水厂消毒处理工艺运行以及管网水质安全保障提供微生物学的基础信息。

表2 PCR-DGGE技术在城镇供水系统中的应用

2.1.1 水源生态系统

(3) 若Uα,取V=[α],则对任意的(x,z)V∘V,存在L,使得(x,y)V, (y,z)V。由[α]的定义知(x→y)⊗(y→z)≥α,同时(y→z)⊗(z→y)≥α。

PCR-DGGE技术可用于藻类水华防治，Ye等[20]利用DGGE技术和实时PCR技术，分析了太湖水体和沉积物样品中蓝藻种群的时空分布及其与水华形成的相关性，研究发现微囊藻和聚球藻为优势蓝细菌，且水华产生和消退与水环境中细菌群落密切相关；Wang等[21]从塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)培养物中提取细菌DNA扩增16S rRNA基因片段，并进行DGGE分析测序，结果发现在藻类裂解过程中“藻际”细菌群落(由于藻向环境释放大量有机物质，使藻细胞周围形成一种独特的、可称为“藻际”的微环境，这种环境中聚集着大量细菌，形成具有独特结构与功能的“藻际”细菌群落)结构发生了明显变化，Alteromonassp.和Thalassobiusaestuariisp.是引起藻类裂解的关键因素，“藻际”细菌产生的β-葡萄糖苷酶和几丁质酶能直接导致藻类裂解；Yang等[22]通过对中国厦门海域Akashiwosanguinea赤潮与其细菌群落的动态关系研究，首次证明了细菌群落特别是丙型变形菌纲(Gammaproteobacteria)在调控赤潮中具有重要的作用，Sediminimonasqiaohouensis细菌与Akashiwosanguinea赤潮呈负相关，这种细菌可能是赤潮的重要负调控因子之一。

PCR-DGGE技术也可用于水源生态系统中真菌群落结构的研究。真菌种类丰富、代谢能力强、生命活动过程复杂，在水源生态系统物质循环中起着重要的作用，水生真菌种类组成及其季节演替是它们在水源生态系统中作用的关键。然而普通引物很难适用于水生真菌群落结构的检测与鉴定，特别是壶菌门和隐真菌门。Ishii等[23]研究发现水生真菌DGGE分析中ff390w/ef3r引物对特异性最高，适合水生真菌群落结构的检测,而f390w/ef3r GC引物对可用于分析检测水生真菌群落结构的演替，这对研究水生真菌群落结构及其季节演替具有重要的意义。

2.1.2 给水处理系统

水处理工艺不同阶段微生物群落结构具有明显的差异性，对饮用水处理过程中微生物群落结构的动态解析可为优化工艺参数提供依据。如张锡辉等[24]利用PCR-DGGE技术对深圳市某水库原水、饮用水处理厂进水及出水微生物群落结构特征进行了研究，结果发现3个细菌类群影响水质,即原水中存在肠道致病菌气单胞菌属影响水源微生物安全性，生丝微菌和光合细菌红假单胞菌均具有净化水质的能力；Tian等[25]在以臭氧/活性炭为主的饮用水处理系统中发现了7种优势菌群，且不同处理阶段优势菌群有所差异，其中拟杆菌和γ-变形杆菌的含量经臭氧和活性炭过滤处理后急剧下降，厚壁菌经臭氧和活性炭处理后逐渐成为优势菌；Ma等[26]采用PCR-DGGE技术对两个不同饮用水处理厂污泥中细菌群落结构进行了初步研究，结果发现污泥微生物群落结构复杂，多种类型微生物大量存在其中，DGGE条带相似性分析得出27条优势条带中包含9种门类，为自来水厂污泥无害化处理提供了有效信息。

2.1.3 管网输配系统

管网输配系统中不同管材内壁提供了不同的生长环境，所附着的管网生物膜微生物群落结构也有所差异，而不同消毒剂的组成和浓度也会影响管网内微生物的群落结构。当管网生物膜因新陈代谢或水力条件改变[27]发生脱落时会影响水体的色度和气味，甚至会对人体健康造成威胁。Rozej等[28]将自来水引入非增塑聚氯乙烯(PVC)、硅烷交联聚乙烯(PEX)和高密度聚乙烯(HDPE)3种不同材料的塑料管道，在系统运行2年后通过扫描电子显微镜、HPC技术、DGGE技术分析管网生物膜微生物的群落结构，结果发现：塑料管网生物膜形成能力因使用材料不同而有所差异，且管网生物膜形成的敏感性表现为HDPE >PEX> PVC；生物膜在管内表面结构和微生物群落结构方面存在差异性；虽然微生物多样性和丰富度受管材影响，但微生物数量与管材无关。 Roeder等[29]通过DGGE技术比较了不同消毒剂对管网生物膜微生物群落结构的影响，结果发现消毒方法引起的管网生物膜微生物种群选择压力取决于消毒剂的组成和浓度，消毒剂对饮用水管网生物膜微生物群落结构产生极大的影响。因此，在评价饮用水设施消毒方法的有效性时，不仅要考虑某些细菌的减少，而且要注意管网生物膜微生物群落结构的变化。

2.2 PCR-DGGE技术在污水处理系统中的应用

活性污泥法和生物膜法是较为常用的污水生物处理方式，通过PCR-DGGE技术了解污水处理过程中微生物群落结构及其动态变化(见表3)，可为污水处理条件的优化、污水处理效率的提高以及废水中微生物资源的利用与开发提供理论依据。

2.2.1 活性污泥法

PCR-DGGE技术可用于比较微生物群落结构的差异以及监测和控制污水处理过程中微生物群落结构的动态变化。 Aell等[30]通过对A2/O和倒置A2/O两种处理系统的活性污泥进行研究，结果发现Microthrixparvicella和NostocoidalimicolaI是导致污泥膨胀的主要原因，这两种处理系统中微生物群落结构的相似性较高，但两种系统在相同周期内经历了不同微生物群落结构的变化，因此处理效果存在一定的差异性；Boon等[31]通过分析4种不同类型污水的活性污泥菌群多样性，结果发现污水种类是影响活性污泥群落结构的重要因素；Liu等[32]对处理中药工业污水的厌氧折流反应器(PABR)中4个不同隔断微生物群落结构进行了研究， DGGE分析显示：在正常负荷下和有机负荷(OLR)稳定阶段，每个隔断微生物群落结构趋于相似；在OLR增高阶段，不同隔断同一取样时间微生物样本的群落结构并不相同，且同一隔断不同取样时间微生物样本的群落结构也不相同；在OLR超负荷运转阶段，出水水质迅速恶化，微生物群落结构变化显著。

表3 PCR-DGGE技术在污水处理系统中的应用

2.2.2 生物膜法

国内外一些学者利用PCR-DGGE技术体系对膜生物反应器(Membrane Bio-Reactor,MBR)和序批式生物膜反应器(Sequencing Biofilm Batch Reactor,SBBR)这两种膜分离技术与生物处理技术有机结合的新型废水处理工艺中生物膜的微生物群落结构进行了研究。如牟洁等[33]利用PCR-DGGE技术研究发现MBR中具有独特的微生物群落结构，其中气单胞菌属、假单胞菌、亚硝酸菌属、从毛单胞菌属和杆菌等优势菌群在该反应器去除有机物的过程中起到了关键作用;Liu等[34]研究了MBR与蚯蚓反应器联合处理综合污水中微生物群落结构及多样性的变化，结果发现联合反应器(S-MBR)中微生物群落结构比传统MBR(C-MBR)更多样化，一些富集在S-MBR中生长缓慢的微生物如腐败螺旋菌、放线菌、固氮菌、梭状芽孢杆菌、假单胞菌等，有利于提高COD去除率、减少污泥量及减缓膜污染；Xin等[35]通过DGGE技术、FISH技术和16S rRNA扩增子焦磷酸测序法研究了SBBR中含氮废水的同步硝化、厌氧氨氧化和反硝化工艺在不同底物浓度下微生物群落结构的变化，结果发现当氨氮浓度从2 200 mg/L下降到50 mg/L时，氨氧化菌的相对含量下降，而厌氧氨氧化细菌相对含量无明显变化，且在反硝化系统中Nitrosomonaseuropaea为氨氧化菌的优势菌属，厌氧氨氧化菌的优势菌属是CandidatusBrocadia;Li等[36]研究了SBBR中林可霉素污水共代谢降解及微生物群落的多样性，DGGE和16S rDNA结果显示共代谢系统中微生物种群多样性较对照组更为丰富，Roseovarius(3.35%)、Thiothrix(2.74%)、Halomonas(2.49%)、Ignavibacterium(2.02%)和Tm7_genus_incertae_sedis(1.93%)为优势菌属，共代谢是不同优势菌属的协同作用，这对林可霉素及其类似物的生物修复具有重要的启示。

2.2.3 自然生物处理法

PCR-DGGE技术可用于自然生物处理系统中微生物群落多样性的检测，能够有效指导调控该系统参数，达到高效净水的目的，目前其在自然生物处理系统的稳定塘和湿地系统中的应用最为广泛。PCR-DGGE技术可研究湿地系统中的微生物数量、丰度及多样性，并分离鉴别湿地系统中具有特定功能的微生物群落[37]，对研究湿地系统的微生物群落结构及分布、污染物降解机制等方面具有重要的意义。如Adrados等[38]利用端点PCR和DGGE技术分析了丹麦3个不同生活污水处理系统(水平流人工湿地、垂直流人工湿地和生物滤池)中细菌和古细菌的群落结构，结果发现微生物群落结构与处理系统设计和有机物负荷有关，而微生物群落与污水进水之间无明确关系；郭冀峰等[39]利用PCR-DGGE技术分析了南北两地区农村稳定塘底泥系统中微生物的群落结构及多样性，结果发现南北方两地区农村稳定塘底泥系统中微生物的群落结构及多样性基本相似，无明显区别。大部分受污染环境的修复是在人工协助下进行的自然生物净化，Hassanshahian等[40]利用PCR- DGGE技术分析了海洋石油污染过程中微生物群落结构的变化，结果发现原油污染会降低海洋微生物群落的多样性；在海洋环境修复过程中，不同种类细菌之间的相互作用会抑制海洋环境的生物修复，使用单一细菌降解海洋石油污染比使用细菌共同体更具有优势。

目前污水无害化处理主要依赖细菌的作用，因为真菌很难与生物反应器中其他微生物竞争。如Badia-Fabregat等[41]研究了污水中细菌和真菌群落对真菌处理性能的影响，结果发现许多土著真菌会与接种真菌竞争影响污水处理的效果。因此，如何解决接种真菌在生物竞争中的劣势问题，还有待进一步探究以期获得良好的污水处理效果。

3 结论与展望

PCR-DGGE技术以其检测限低、快速、准确、全面等优点被广泛应用于微生物分子生态学研究领域，同时该技术自身也在不断完善，正与越来越多的新兴技术方法融合发展，并在城镇供排水系统中微生物群落结构及多样性研究方面得到了广泛应用：①分离鉴定城镇供水系统中优势菌群，有效防治水华及调控赤潮，监测控制水处理过程中藻类与致病微生物的暴发，为提高供水系统生物稳定性提供技术支撑；②分析研究城镇污水处理系统中微生物矿化污染物的原理及作用过程，为提高污染物处理效率、优化污染物处理工艺及修复受污染环境提供理论指导。

PCR-DGGE技术作为分子生物学研究的技术手段已经较为成熟，结合城镇供排水系统微生物多样性的研究现状与发展趋势，未来仍需从以下几方面继续开展系统、深入的研究：①针对PCR-DGGE技术应用过程中存在的共迁移和异质性等问题，改进技术方法或结合新兴技术降低这些问题对研究结果的影响，以提高基因片段分离率与结果准确性；②系统探索细菌、真菌和藻类等其他类型水生微生物群落结构的研究方法，进一步完善技术应用方法学体系，以拓宽技术应用领域和范围；③深入探讨微生物群落结构对水环境的作用机理及其影响因素，提高城镇供水系统的生物稳定性和城镇污水处理系统的处理效率，并探明微生物群落与其他类型群落之间的相互作用，进一步评价生态系统功能，为水环境生态系统的修复与保护提供有力的科学依据。