SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质条件的响应面优化分析

夏 雄，邓 妍，刘 威，陆天阳，许 霞，王怡人，罗俊杰

(1.常州大学环境与安全工程学院,江苏 常州 213164；2.常州大学怀德学院,江苏泰州 214500；3.邯郸市环境保护局督查中心,河北 邯郸 056000)

酶水解法提取剩余污泥蛋白质是利用酶制剂水解破坏剩余污泥细菌的细胞壁，从而达到使细胞破裂，胞内物质溶出的目的[1-4]。目前使用酶水解法提取剩余污泥蛋白质主要存在对细胞壁的破坏效果较差，需要大量的水解酶进行长时间的水解过程，从而造成成本较高等问题[5]。十二烷基硫酸钠(SDS)作为一种阴离子表面活性剂，在其分子两端分别分布着亲水基和憎水基，形成了一种特殊的不对称结构[6]，正是这种独特的分子结构，使得SDS具有良好的两亲性和增溶作用[7-8]。因此，本次试验选取添加SDS表面活性剂来促进复合酶水解剩余污泥蛋白质，并在研究复合酶(碱性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=4∶1)水解法提取剩余污泥蛋白质的最佳提取条件(液固比为5∶1、复合酶加酶量为5.23%、反应温度为54.7℃、初始pH值为7.7和反应时间为3.2 h，剩余污泥蛋白质最大提取率为60.83%)的基础上，研究了SDS对复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的促进作用，并通过响应面分析法优化其提取条件。

1 材料与方法

1. 1 污泥样品

剩余污泥来源于江苏省常州市某市政污水处理厂压结后的固体污泥，取回污泥样品后存放在冰箱内，调节温度至(4±0.5)℃。该剩余污泥样品的相关特性指标为：pH值6.7，含水率78.6%，蛋白质含量40.2%(相对于剩余污泥干物质的质量)。

1. 2 主要试剂和仪器

本试验所用试剂主要包括：木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、SDS、福林酚试剂、牛血清白蛋白、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、甲基红、亚甲基蓝和溴甲酚绿等。

本试验所用仪器主要包括：电热鼓风干燥箱、pH计、多头磁力加热搅拌器、新世纪紫外/可见分光光度计、离心沉淀器和凯氏定氮装置等。

1. 3 测定方法

(1) 剩余污泥中蛋白含量按照我国食品安全国家标准《食品中蛋白质的测定》(GB 5009.5—2010)中的方法进行测定。

(2) 剩余污泥蛋白质提取液的蛋白质含量采用福林酚试剂法进行测定。

1. 4 试验方法

SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的试验方法如下：先取适量剩余污泥置于250 mL烧杯内，按照液固比为5∶1向烧杯内添加适量的蒸馏水，之后通过一定浓度的稀盐酸或稀氢氧化钠溶液调节pH值；然后调节水浴温度至所需恒定温度，按照5.23%的添加量(相对于污泥质量)加入一定量的复合酶，并按照复合酶的加酶量加入一定量的SDS，在一定转速条件下搅拌、水解一段时间，反应结束后，将污泥料浆置于100℃水浴条件下15 min，将蛋白酶灭活；最后将污泥料浆倒入离心管，在4 000 r/min转速下离心10 min，离心后取上清液，即为剩余污泥蛋白质提取液。

1. 5 试验方案

首先在确定复合酶加酶量为5.23%和提取过程中液固比为5∶1的条件下进行单因素试验，分别考察初始pH值(7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0)、反应温度(51℃、53℃、55℃、57℃、59℃和61℃)、反应时间(1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h)和SDS投加量(6%、7%、8%、9%、10%和11%)4个因素对SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质提取率的影响；然后根据单因素试验结果，采用响应面分析法，以剩余污泥蛋白质的提取率(R)为响应值，研究初始pH值(A)、反应温度(B)、反应时间(C)和SDS投加量(D)对响应值(R)的影响，每个因素取3个水平，设计了四因素三水平的响应面优化试验。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果与分析

2.1.1 初始pH值对SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的影响

本试验设置反应过程中初始pH值分别为7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0，其他反应条件为：液固比5∶1，复合酶加酶量5.23%，反应温度55℃，反应时间3 h，SDS投加量8%，考察了初始pH值对SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的影响，其试验结果见图1。

图1 初始pH值对SDS促进复合酶水解法提取剩余 污泥蛋白质的影响Fig.1 Effect of initial pH on protein extraction from excess sludge with enhanced enzymatic hydrolysis by SDS and complex enzyme

由图1可见，SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质最适宜的初始pH值为7.4，此时剩余污泥蛋白质的提取率为65.51%；添加SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质最适宜的初始pH值为7.4，相较于未添加SDS的复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质最适宜的初始pH值7.7有所降低，这是因为SDS作为添加剂会提高反应体系的pH值。分析原因认为：一方面，SDS在蒸馏水中溶解后本身就处于弱碱性的状态，故当其作为添加剂时会使反应体系的pH值稍有上升；另一方面，在复合酶水解提取剩余污泥蛋白质的初期，反应体系的pH值主要受氨氮等物质的影响，而这些物质又属于碱性物质，在SDS的加入促进复合酶水解的同时直接导致氨氮等碱性物质的含量增大，最终使得反应体系的pH值有所上升。

2.1.2 反应温度对SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的影响

本试验设置反应温度分别为51℃、53℃、55℃、57℃、59℃和61℃，其他反应条件为：液固比5∶1，复合酶加酶量5.23%，初始pH值7.4，反应时间3 h，SDS投加量8%，考察了反应温度对SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的影响，其试验结果见图2。

图2 反应温度对SDS促进复合酶水解法提取剩余污 泥蛋白质的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on protein extraction from excess sludge with enhanced enzymatic hydrolysis by SDS and complex enzyme

由图2可见，反应温度对SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的效果有较大的影响，在反应温度为51～57℃的范围内，SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的提取率与反应温度呈正相关，但当反应温度继续升高超过57℃后，SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的提取率与反应温度呈负相关。分析原因认为：虽然添加了SDS后，随着反应温度的升高，SDS的增溶效果越来越显著，更有利于大量的碳水化合物和蛋白质脱离污泥颗粒表面并溶解到液相中，但是在复合酶水解提取污泥蛋白质的过程中并不是反应温度越高越有利，这是因为复合酶本身也是一种蛋白质，超过最合适温度后会导致蛋白质变性，大部分酶蛋白质结构被破坏，从而造成蛋白酶不能正常发挥催化作用。故SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质最适宜的反应温度为57℃，此时剩余污泥蛋白质的提取率为67.53%。

2.1.3 反应时间对SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的影响

本试验设置反应时间分别为1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h，其他反应条件为：液固比5∶1，复合酶加酶量5.23%，初始pH值7.4，反应温度57℃，SDS投加量8%，考察了反应时间对SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的影响，其试验结果见图3。

图3 反应时间对SDS促进复合酶提取剩余污泥蛋白 质的影响Fig.3 Effect of reaction time on protein extraction from excess sludge with enhanced enzymatic hydrolysis by SDS and complex enzyme

由图3可见，在反应时间为2.5 h时出现了SDS促进复合酶提取剩余污泥蛋白质提取率的最大值68.32%，与复合酶提取剩余污泥蛋白质时最适宜的反应时间3.2 h相比，剩余污泥蛋白质的提取率的最大值出现时间提前。分析原因认为：SDS作为一种表面活性剂，具有一定的增溶作用，主要表现为在复合酶水解提取剩余污泥蛋白质过程中，SDS的加入使得原本吸附于污泥表面的碳水化合物和蛋白质提前脱附，也就是说原本难以破坏的胞外多聚物被提前破坏，复合酶更加直接地作用于污泥微生物细胞，复合酶水解的反应速率持续增大，从而导致SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的提取率的最大值提前出现。

2.1.4 SDS投加量对SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的影响

本试验设置SDS投加量分别为6%、7%、8%、9%、10%和11%，其他反应条件为：液固比5∶1，复合酶加酶量5.23%，初始pH值7.4，反应温度57℃，反应时间2.5 h，考察了SDS投加量对SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的影响，其试验结果见图4。

图4 SDS投加量对SDS促进复合酶水解法提取剩余 污泥蛋白质的影响Fig.4 Effect of SDS dosage on protein extraction from excess sludge with enhanced enzymatic hydrolysis by SDS and complex enzyme

由图4可见，随着SDS投加量的增加，SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的提取率逐渐升高，在SDS投加量从6%增加到8%的过程中，剩余污泥蛋白质的提取率不断上升；当SDS投加量超过8%后，SDS投加量的增加并没有引起剩余污泥蛋白质提取率的明显变化。分析原因认为：SDS作为一种阴离子表面活性剂，在SDS投加量较少的情况下其增溶作用表现显著，但是当SDS投加量过多时，其增溶作用趋于饱和，出现剩余污泥蛋白质提取率不再继续升高的现象。故综合考虑确定SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质最佳的SDS投加量为8%，此时剩余污泥蛋白质的提取率达到68.34%。

2.2 SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质提取工艺的响应面优化试验结果与分析

2.2.1 响应面优化试验设计与结果分析

根据单因素试验结果，本文利用响应面分析法，采用Design Expert 10软件中的Box-Behnken Design模型设计响应面优化试验的相关试验方案[9-10]，设定响应面优化试验的4个因素分别为初始pH值(A)、反应温度(B)、反应时间(C)和SDS投加量(D)，并确定各因素的3个水平，设计了四因素三水平的响应面优化试验，详见表1。响应面优化试验过程中其余试验条件分别如下：复合酶中碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶之比为4∶1，复合酶加酶量为5.23%，液固比为5∶1。

表1 响应面优化试验因素水平设计表

通过将响应面优化试验得到的试验值代入响应面分析表，并对其进行响应面回归分析，得到模型的预测值，见表2。

表2 响应面优化试验设计与结果

通过响应面分析对响应值R与自变量A、B、C、D之间的关系进行数学关系表达，得到拟合的回归方程模型如下：

R=69.65+0.47×A-0.59×B+0.24×C+0.25×D+0.23×A×B-0.22×A×C-0.092×A×D+0.29×B×C+0.065×B×D+0.095×C×D-1.75×A2-4.40×B2-0.50×C2-0.81×D2

式中：R为剩余污泥蛋白质的提取率(%)；A为初始pH值；B为反应温度(℃)；C为反应时间(h)；D为SDS投加量(%)。

对上述拟合得到的回归方程模型进行显著性检验及方差分析，其结果见表3。

由表3可见，该回归方程模型p<0.000 1，为差异极显著，失拟项p=0.230 1>0.05，为差异不显著，说明利用该响应面分析结果拟合得到的回归方程模型具有显著意义。

表3 回归方程模型的显著性检验及方差分析

注：“**”表示显著性水平为差异极显著，p<0.01；“*”表示显著性水平为差异显著，0.01

相关系数(R2)和调整相关系数(R2Adj)是检验模型可信度和准确性的指标，两者数值越接近且越接近1，则证明模型的可信度和准确性越高，模型拟合结果越能有效地反映试验数据。本试验方案中，相关系数R2=0.963 1和调整相关系数R2Adj=0.926 3，表明回归方程模型对试验数据的拟合情况较好，适用于对SDS促进复合酶水解提取剩余污泥蛋白质的提取率进行分析与预测。通过F值大小可以得出各试验因素对SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的影响显著性由强至弱顺序为：反应温度>初始pH值>SDS投加量>反应时间。

为了保证响应面分析所得模型的准确性，通过Design Expert 10软件对预测值与实测值的误差进行了更深入的分析，主要通过残差值的计算来对标准偏差偏离实测值及预测响应值的程度进行表征。图5为内部学生化残差分布与标准正态分布的概率关系图，图6为内部学生化残差与试验序号的关系图，图7为剩余污泥蛋白质提取率实测值与预测值的关系图。

图5 内部学生化残差与标准正态分布的概率关系图Fig.5 Relationship between the internally studentized residuals and normal probability distribution

图6 内部学生化残差与试验序号的关系图Fig.6 Relationship between the internally studentized residuals and the experimental number

图7 剩余污泥蛋白质提取率实测值与预测值的关系图Fig.7 Relationship between the actual and the predicted protein extraction rate

由图5、图6和图7可见，本次试验的数据点呈现出线性分布模式，未出现特别明显的异常点，说明本次响应面回归分析所得到的二次回归方程模型具有较为良好的拟合度(见图5)；本次试验中涉及的所有数据点均呈现出随机分布状态，未发现任何的分布规律和变化趋势，大部分内部学生化残差均分布在±3范围之内，从而更加证明了本次响应面回归分析所得到的二次回归方程模型的拟合度具有较高的准确性(见图6)；本次试验的所有数据点几乎平均分布于一条直线上，该直线的斜率刚好为1,说明本次响应面回归分析所得到的预测值与实测的试验值吻合情况良好，进一步证明本次响应面回归分析所得到的二次回归方程模型具有较为良好的拟合度(见图7)。

2.2.2 各因素对剩余污泥蛋白质提取率影响显著性的响应面分析

为了更加直观地观察初始pH值、反应温度、反应时间和SDS投加量各因素之间的交互作用对剩余污泥蛋白质提取率的影响，本文绘制了各因素两两之间交互作用的三维响应面分析曲面图，见图8至图13。

图8 初始pH值与反应温度(T)之间交互作用的三维响 应面分析曲面图Fig.8 Three dimensional surface diagram of response surface analysis of the interaction between initial pH and temperature (T)

图9 初始pH值与反应时间(t)之间交互作用的三维响 应面分析曲面图Fig.9 Three dimensional surface diagram of response surface analysis of the interaction between initial pH and reaction time(t)

图10 初始pH值与SDS添加量(W)之间交互作用的 三维响应面分析曲面图Fig.10 Three dimensional surface diagram of response surface analysis of the interaction between initial pH and SDS dosage (W)

图11 反应温度(T)与反应时间(t)之间交互作用的 三维响应面分析曲面图Fig.11 Three dimensional surface diagram of response surface analysis of the interaction between reaction temperature (T) and reaction time (t)

图12 反应温度(T)与SDS投加量之间交互作用的 三维响应面分析曲面图Fig.12 Three dimensional surface diagram of response surface analysis of the interaction between reaction temperature (T) and SDS dosage (W)

图13 SDS投加量与反应时间(t)之间交互作用的三维响 应面分析曲面图Fig.13 Three dimensional surface diagram of response surface analysis of the interaction between SDS dosage and reaction time

由图8可见，初始pH值与反应温度之间的交互作用对剩余污泥蛋白质提取率的影响三维响应面分析曲面近似为椭圆，表明因素A与B之间的交互作用对剩余污泥蛋白质提取率的影响较为显著；而从三维响应面分析曲面的坡度可以看出，反应温度的影响要大于初始pH值。

同样，由图9至图13可见，因素A与C之间的交互作用对剩余污泥蛋白质提取率的影响较为显著，初始pH值的影响要大于反应时间；因素A与D之间的交互作用对剩余污泥蛋白质提取率的影响较为显著，初始pH值的影响要大于SDS投加量；因素B与C之间的交互作用对剩余污泥蛋白质提取率的影响十分显著，反应温度的影响要远远大于反应时间；因素B与D之间的交互作用对剩余污泥蛋白质提取率的影响十分显著，反应温度的影响要远远大于SDS投加量；因素C与D之间的交互作用对剩余污泥蛋白质提取率的影响不显著，SDS投加量的影响要略大于反应时间。

通过图8至图13的响应面分析曲面图，更加直观地表明了SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质响应面优化试验中，各因素的影响显著性由强至弱表现为：反应温度>初始pH值>SDS投加量>反应时间。

2.2.3 验证性试验

对响应值R进行最大化计算，计算得到SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质提取率的最大值和对应的最优提取条件，见图14。

图14 响应面法优化结果Fig.14 Optimization results of the response surface methodology

根据对应的编码值计算，可得到响应面优化后的最佳提取条件为：初始pH值A取7.423、反应温度B取56.887℃、反应时间C取2.606 h、SDS投加量D取8.156%，此时响应值剩余污泥蛋白质的提取率R的最大值为69.739%。

为了验证模型预测的准确性，按照优化后的提取条件，并考虑到试验过程中各因素控制的精确度影响，在修正条件下(初始pH值为7.4、反应温度为56.9℃、反应时间为2.6 h、SDS投加量为8.16%)进行了3次重复性验证试验，所得剩余污泥蛋白质提取率R的平均值为69.12%，与响应面回归模型所得到的预测值(69.739%)十分接近，说明本次响应面分析所得的回归模型可以很好地预测实际试验所得结果，表明通过响应面优化得到的SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的工艺条件确实可行，具有实际应用价值。

3 结 论

本文以江苏省常州市某市政污水处理厂的剩余污泥为原料，将SDS作为添加剂，研究其对复合酶(碱性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=4∶1)水解法提取剩余污泥蛋白质的促进作用，并根据前期试验结果，在确定液固比为5∶1和复合酶加酶量为5.23%的条件下，以剩余污泥蛋白质的提取率为指标，通过SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的相关试验，主要得到以下结论：

(1) 通过对SDS投加量、反应温度、初始pH值和反应时间因素进行单因素试验和响应面优化试验，确定SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质的最佳提取条件为：液固比5∶1、复合酶加酶量5.23%、初始pH值7.4、反应温度56.9℃、反应时间2.6 h、SDS投加量8.16%。在该提取条件下剩余污泥蛋白质提取率的最大值可达69.12%，比仅使用复合酶的提取率(60.83%)提高了8.29%。

(2) 在首先确定液固比和复合酶加酶量的条件下，通过响应面分析得到SDS促进复合酶水解法提取剩余污泥蛋白质各因素的影响显著性由强至弱表现为：反应温度>初始pH值>SDS添加量>反应时间。