含有金银花的3种中药制剂的微生物限度与控制菌检查法的建立及方法学验证

杜春华，张晓南，游燕*，李东娴，王鹏，曹红云

药品微生物限度是药品安全性的重要指标之一。在中药制剂处方中，有些药材自身对微生物细胞有一定抑制作用。不同中药制剂的抑菌成分与作用强弱不同，供试品中的微生物在抑菌成分存在下可能检不出，为了消除其对微生物的影响，需对每种样品建立适宜的微生物限度检查法[1]。金银花具有清热解毒，疏散风热的功效。用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热[2]。市面上销售的很多中成药都含有金银花成分[3～4]，本研究选取3种含金银花的中成药双黄连口服液、金银花复方颗粒、金银花露，依据2015年版《中国药典》四部中通则1105、1106对3种制剂的微生物限度与控制菌的检查方法进行方法学验证，为含该类中药材的药品制定微生物检查提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

隔水式电热恒温培养箱（型号：G S P-9160MBE，上海博迅实业有限公司），生化培养箱（型号：LRH-150，上海一恒科学仪器有限公司），二级生物安全柜（型号：BSC-1100ⅡB2-X，济南鑫贝西）

1.2 试药

1.2.1 供试品 双黄连口服液：（批号：170213012、170104032、170105032），金银花复方颗粒：（批号：7274507、7274404、7274502），金银花露：（批号：170404、170405、170406）

1.2.2 培养基 胰酪大豆胨液体培养基，批号170310；胰酪大豆胨琼脂培养基，批号1706282；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号170608；沙氏葡萄糖液体培养基，批号3106032；麦康凯琼脂培养基，批号160303；麦康凯琼液体培养基，批号161228；pH 7.0无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液，批号1705184。（以上培养基除沙氏葡萄糖液体培养基来源于广东环凯微生物科技有限公司其余培养基均来源于北京三药科技开发公司。）

1.3 试验菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]铜绿假单胞[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003],均来源于中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

按《中国药典》2015版四部通则1105、1106、1107要求，确定口服给药项下的固体制剂和液体制剂（不含药材原粉的中药制剂）需检查需氧菌总数，霉菌和酵母菌总数，控制菌检查大肠埃希菌。

2.1 菌液制备

2.1.1 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞、枯草芽孢杆菌的制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35 ℃培养18～24 h，然后将各菌种分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含菌数不大于100cfu的菌悬液。

2.1.2 白色念珠菌、黑曲霉的制备 接种白色念珠菌、黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，置20～25 ℃分别培养2～3天和5～7天，然后将各菌种分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含菌数不大于100 cfu的菌悬液。

2.2 供试液制备

固体制剂取供试品10 g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml中溶解，混匀，作为1:10的供试液。液体制剂取供试品10 ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90 ml中溶解，混匀，作为1:10的供试液。

3 微生物限度方法验证

3.1 需氧菌总数计数方法适用性试验

试验组:取1:10供试液9.9 ml于灭菌试管中，加入制备好的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1 ml，使其终浓度为每1 ml含菌落数不大于100 cfu的菌液，从试管中吸取1 ml注入灭菌平皿中，立刻倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，待其凝固后，倒置于恒温培养箱中30～35℃培养48 h。每个菌种平行制备2个平皿，测定试验组的菌落数。

供试品对照组:取1:10供试液9.9 ml于灭菌试管中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液0.1 ml，其余按试验组操作，测定供试品对照组的菌落数。

菌液对照组:取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9 ml于灭菌试管中，加入制备好的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1 ml，使其终浓度为每1 ml不大于100 cfu的菌液，其余按试验组操作，测定菌液对照组的菌落数。

阴性对照组:取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml，加入霉菌平皿中，其余按试验组操作，平行做两个皿。

按[回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数]计算回收率，结果见表1、表2、表3。

表1 双黄连口服液需氧菌总数试验验证结果

表2 金银花复方颗粒需氧菌总数试验验证结果

表3 金银花露需氧菌总数试验验证结果

由表1、表2、表3得出，5株需氧菌的回收比值均在0.5 ～ 2 之间，符合药典规定，因此可照此常规法进行双黄连口服液、金银花复方颗粒、金银花露的需氧菌总数计数。

3.2 霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验

取1:10供试液9.9 ml于灭菌试管中，加入制备好的白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1 ml，使其终浓度为每1 ml含菌落数不大于100 cfu的菌液，从试管中吸取1 ml注入灭菌平皿中，立刻倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，待其凝固后，倒置于恒温培养箱中20～25 ℃培养72 h。每个菌种平行制备2个平皿，测定试验组的菌落数。同法测定供试品对照组、菌液对照组和阴性对照组的菌落数。按[回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数]计算回收率，结果见表4、表5、表6。

表4 双黄连口服液霉菌和酵母菌总数试验验证结果

表5 金银花复方颗粒霉菌和酵母菌总数试验验证结果

表6 金银花露霉菌和酵母菌总数试验验证结果

由表4、表5、表6得出，2株真菌的回收比值均在0.5 ～ 2 之间，符合药典规定，因此可照常规法进行双黄连口服液、金银花复方颗粒、金银花露的霉菌和酵母菌总数计数。

3.3 控制菌检查方法适用性验证

3.3.1 常规法检查大肠埃希菌

试验组

取1:10供试液10 ml及制备好的大肠埃希菌菌悬液1 ml加入到100 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，35℃培养24小时后吸取1 ml培养物接种至100 ml麦康凯液体培养基中，42 ℃培养24小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，35 ℃培养24小时，观察是否有菌落生长。

阳性对照组

取制备好的大肠埃希菌菌悬液1 ml加入到100 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，35 ℃培养24小时。其他操作同试验组。

阴性对照组

取10 mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液加入到100 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，35 ℃培养24小时。其他操作同试验组。

供试品对照组

取1:10供试液10 ml加入到100 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，35 ℃培养24小时。其他操作同试验组。

表7 大肠埃希菌检查方法(胰酪大豆胨液体培养基：100ml)验证结果

由表7得出，3个制剂的试验组和阳性对照组检出大肠埃希菌，阴性对照试验组无菌生长，3个制剂的大肠埃希菌可用常规法进行检查。

4 讨论

中药制剂含有多种成分的复合制剂，其中任何成分具有均可影响微生物限度检查的准确性，因此同其他分析方法一样，药品微生物限度检查也应证明所采用的方法是适宜的，才能保证检查方法的完整性和准确性[5]。依据2015年版《中国药典》的规定，为了确认所采用的方法适合用于某制剂的微生物限度检查，必须对相应检验方法进行方法学验证。本次实验中所选用的双黄连口服液、金银花复方颗粒、金银花露制剂都进行了微生物限度方法的建立并进行了验证，确立了检查方法有效。虽然文献上[6～8]有记载金银花内的绿原酸成分，具有极强的抗菌、抗病毒功能，但是实验结果显示，3个含有金银花的制剂对药典规定验证用5种试验菌株（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉）的抑菌活性较小，均可采用常规法。对3个含有金银花的中药制剂控制菌检查方法有效性验证结果表明，3个制剂的控制菌均可使用常规法进行检查。