细菌内毒素多次给药对家兔致热灵敏度影响的研究

晏成倩，赵璐，王红平，易恒，黄梅梅，黄明，曾南

家兔热原检查作为药品质量控制的一种重要手段，能直观反映各种热原对生物体的致热特点和程度。影响家兔热原检查结果的因素很多，家兔的敏感性是其中一个很重要的因素。2015 年版 《中国药典》四部通则中热原检查法不限定家兔的使用次数[1]，但对使用多次的家兔和休息后的高温兔进行灵敏度检查，能提高实验的准确性和重复性，对规范热原检查具有非常重要的意义。因此通过以下实验探讨细菌内毒素多次给药对家兔致热灵敏度的影响。

1 实验材料

1.1 动物

新西兰兔，普通级，雌雄兼有，体重2.1～3.5 kg，由四川省实验动物专委会养殖场提供，动物生产许可证号：SCXK（川）2013-14。饲养条件：温度20 ℃～26 ℃，相对湿度40 %～70 %，12 / 12小时明暗交替照明。

1.2 试药

细菌内毒素工作标准品（CSE，中国药品生物制品检定研究院，规格：80 EU/支，批号：150601-201784）；细菌内毒素检查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，规格：50 mL，批号：17033005）；氯化钠注射液（四川科伦药业股份有限公司，批号：G117062804）

细菌内毒素溶液配制：用细菌内毒素检查用水溶解细菌内毒素工作标准品，于涡旋混合器上混匀15 min，然后使用氯化钠注射液进行稀释，最终稀释至2个浓度1 EU﹒mL-1、0.5 EU﹒mL-1、0.25 EU﹒mL-1。

1.3 仪器

ZRY-2D型智能热原仪（天津市天大天发科技有限公司）；MS3 型旋涡混和器( 德国 IKA 公司)；OMH 180 SS 型高温烘箱( Thermo Scientific Heratherm)；试验所用器皿均经250 ℃烘烤2 h去除外源性细菌内毒素。

2 实验方法

按照 2015 年版 《中国药典》 四部通则热原检查法规定进行新兔挑选。热原检查前进行基础体温测定，取符合热原检查法规定的家兔36只，随机分成3个组，每组12只。分别给予10 EU﹒kg-1、5 EU﹒kg-1、2.5 EU﹒kg-1的细菌内毒素剂量，每组注射体积均为10 mL﹒kg-1。每组家兔共注射4次细菌内毒素标准品溶液，每次间隔17 d。给药后每隔30分钟测量一次体温，共测量6次。若第2、3、4次热原检查前进行基础体温测定时，有家兔不符合规定则将其淘汰。记录每组家兔每次给药的动物数，计算平均最大升温值（降温均以0℃计）、升温率（最大升温≥0.6 ℃的动物数/动物数）和入选率（入选动物数/动物数）。

3 实验结果

实验结果显示，每次给药后，家兔在1.5 h左右升温可达到最大值，各组升温幅度随细菌内毒素剂量的增加而增大，组间有明显统计学差异（P＜0.05或0.01），其中5 EU﹒kg-1和10 EU﹒kg-1的平均升温均超过0.6 ℃，升温率超过60 %，热原反应呈阳性结果，而随着给药次数的增加，同一剂量组的平均升温未产生明显变化，而家兔入选数则减少。同时家兔入选率还与细菌内毒素剂量呈明显相关性，剂量越大，入选率越低，其中以10 EU﹒kg-1表现尤为显著，从最初12只到第2次给药9只，再到第3次给药8只，最后第4次给药仅4只。另外，详见表1、表2和图1、图2。

表1 各组家兔注射细菌内毒素后体温平均升温值及升温率

表2 各组家兔注射细菌内毒素的入选动物数及入选率

图1 不同剂量的细菌内毒素致家兔体温升高情况图

图2 各剂量组家兔入选数量变化图

4 讨论

《中国药典分析检测技术指南》建议采用5 EU﹒kg-1（或10 EU﹒kg-1）内毒素剂量按热原检查法对家兔进行灵敏度考核验证，故本实验选择2.5 EU﹒kg-1、5 EU﹒kg-1和10 EU﹒kg-1的细菌内毒素作为多次给药的剂量。另外药典规定升温达0.6 ℃的家兔应休息2周以上，考虑到家兔体重增长和药典规定3周内未曾使用的家兔应在检查供试品前7日内进行预测体温，所以每次间隔17 d给药。

从首次给药看，家兔最低灵敏度可达到5 EU﹒kg-1，注射剂人每千克体重每小时最大可接受细菌内毒素剂量为5 EU﹒(kg﹒h)-1，所以在考察家兔灵敏度时，应把5 EU﹒kg-1作为最低检测限。另外，因为10 EU﹒kg-1剂量能致家兔接近100 %发热，更适合在注射剂进行适用性考察时使用。

文献报道，家兔短期内多次接触细菌内毒素剂量可产生耐受性，降低其对热原物质的灵敏度，造成假阴性结果[3～6]。同时药典规定供试品判定为不符合规定，则组内全部家兔不再使用。但在本实验中各剂量组家兔每次给药后平均升温值变化不大，表明注射细菌内毒素溶液的家兔休息17 d后其对热原物质的灵敏度不会降低，可继续用于热原检查。所以升温家兔休息后再利用是可行的，这有利于提高热原检查家兔的利用率，亦符合3R原则。

另外，从每次给药家兔只数看，剂量越大的组，热原检查前基础体温符合规定家兔数越少，所以对休息后升温家兔进行重新选兔后再使用很有必要。同时家兔接受低于阈剂量的细菌内毒素后，休息两周以上时，其对细菌内毒素灵敏度升高，这对热原检查的影响需更进一步研究。