三黄泻心汤及其有效组分对大鼠的总胆汁酸代谢影响

刘巧，李奇娟，谢余，高玉莲，王战军，胡慧玲，王战国

三黄泻心汤始载于张仲景的《金匮要略》，由大黄、黄连、黄芩三味中药组成，用于治疗“心气不足，吐血衅血”血热证的代表方剂，具泻火解毒，清热燥湿等功效[1～3]。胆汁酸在消化中调节肠道微生物群，调节胆固醇、脂质和葡萄糖体内平衡所必需的途径中起重要作用[4]。胆汁酸代谢反映了肠道菌群的代谢稳定性，反映了肝-肠循环的药物代谢过程[5～6]。研究表明，大黄中大黄素可通过降低总胆汁酸来治疗胆汁淤积[7～9]，而对于三黄泻心汤及其有效组分对于总胆汁酸的代谢影响尚未明确报道。因此，本课题对泻心汤及其有效成分不同配伍组分对大鼠在24 h内的总胆汁酸代谢影响进行了研究，以期找出药物对大鼠血清总胆汁酸（Total bile acid, TBA）分泌的影响，为后期的病理模型研究和临床上胆汁酸代谢性疾病的研究奠定一定的基础。

1 实验材料与仪器

1.1 试药

大黄素（长沙中仁生物科技有限公司，批号：161022，纯度＞98%），盐酸小檗碱（长沙中仁生物科技有限公司，批号：161102 ，纯度＞97%），黄芩苷（长沙中仁生物科技有限公司，批号：161105，纯度＞95%）；大黄药材（四川省中药饮片有限责任公司，批号：161010），黄连药材（四川省中药饮片有限责任公司，批号：170330），黄芩药材（四川省中药饮片有限责任公司，批号：160827），经鉴定，药材各项指标均符合2015年版《中华人民共和国药典》规定项下要求。大鼠血清总胆汁酸（TBA）酶联免疫分析试剂盒（上海盈公实业有限公司，批号：20170708）。

1.2 仪器

TGL-16C型离心机（上海安亭科学仪器厂）；BT125D电子天平（德国赛多利斯）；352型酶标仪（Labsystems Multiskan MS）。

2 试验方法

2.1 TBA测定原理

TBA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠总胆汁酸（TBA）水平。用纯化的大鼠总胆汁酸（TBA）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入总胆汁酸（TBA），再与HRP标记的总胆汁酸（TBA）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的总胆汁酸（TBA）呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠总胆汁酸（TBA）浓度。

2.2 样品溶液的制备

所有分组灌胃给药体积为4 mL/只，按2015年版《中国药典》[1]中三黄片量扩大10倍计算。灌胃溶液的具体配制方法如下：

2.2.1 大黄素灌胃液的配制

取大黄素40 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，用2.5 mL乙醇溶解（超声溶解）后，加生理盐水稀释至刻度线，即得浓度约为0.8 mg﹒mL-1的大黄素灌胃溶液。

2.2.2 大黄素+盐酸小檗碱配比灌胃液的配制 取大黄素40 mg、盐酸小檗碱120 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，用2.5 mL乙醇溶解（超声溶解）后，加生理盐水稀释至刻度线，即得。

2.2.3 大黄素+盐酸小檗碱+盐黄芩苷配比灌胃液的配制 取大黄素40 mg、盐酸小檗碱120 mg、黄芩苷360 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，用2.5 mL乙醇溶解（超声溶解）后，加生理盐水稀释至刻度线，即得。

2.2.4 三黄泻心汤合煎液的制备 取大黄粉末60 g、黄连粉末30 g、黄芩粉末30 g（过四号筛），精密称定，以上三味，加入10倍量纯水浸泡30 min后煎煮三次，第一次1.5 h，第二次1 h，第三次40 min，合并煎液，趁热滤过，即得煎煮液约400 mL。

2.3 实验动物分组及给药剂量

30只雄性SD大鼠，体重250 g左右，随机分为A、B、C、D、control五组，每组6只，A组：大黄素+盐酸小檗碱+黄芩苷配比组； B组：大黄素+盐酸小檗碱配伍组；C组：大黄素组；D组：三黄泻心汤组；Control组：空白生理盐水组。实验前适应饲养一周，给予标准光照周期（14 h光照、10 h黑夜），实验室温度维持在20～25 ℃，相对湿度控制在70 %左右。实验前给予自由饮水并禁食12 h，试验当天早晨称重，按预定剂量给药4 mL/只。

2.4 大鼠血清的收集及测定方法

实验前，先收集空白血清0.5 mL，然后分别灌胃给予各组设计给药剂量，随后于灌胃后15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h采用大鼠断尾取血法收集血液0.5 mL，室温静置30 min后，以12000 r﹒min-1离心10 min，取上层血清，于-80 ℃ 冻存，备用。

按照TBA试剂盒说明书的操作说明，首先分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50 µL，待测样品孔中先加样品稀释液40 µL，再加待测样品10 µL（样品最终稀释度为5倍）。然后将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。随后用封板膜封板后置37 ℃温育30 min。随后小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液（将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后用），静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。随后每孔加入酶标试剂50 µL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃ 温育30 min。洗涤5次。然后每孔先加入显色剂A 50 µL，再加入显色剂B 50 µL，轻轻震荡混匀，37 ℃ 避光显色10 min。最后，每孔加终止液50 µL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。以空白孔调零，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），测定在15 min以内完成。

2.5 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件，数据用（ S）表示，计量资料先进行正态检验，正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料先转换成正态分布再用单因素方差分析。进行组间比较，P＜0.05为数据统计有显著性差异。

3 试验结果

3.1 标准曲线的建立

精密吸取试剂盒中标准品溶液稀释成相应浓度（20、10、5、2.5、1.25、0 μmoL﹒L-1），按“2.4 大鼠血清的收集及测定方法”测定，以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。线性方程为：y=11.8721x-0.2815，r=0.9987，结果表明标准品在0～20 μmoL﹒L-1范围内呈良好线性关系，可用于后期血清样品中TBA的检测。

图1 标准曲线图

3.2 三黄泻心汤及其有效组分对大鼠的总胆汁酸代谢影响

根据样品的OD值由标准曲线计算出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中总胆汁酸（TBA）实际浓度。结果见表1和图2。

表1 三黄泻心汤及其有效组分灌胃大鼠24 h内总胆汁酸的浓度 (S, 单位:μmol﹒L-1;n=6)

图2 三黄泻心汤及其有效组分对大鼠的总胆汁酸代谢影响差异(单位：μmol﹒L-1；n=6)

以上结果表明各组之间与空白组对比，经SPSS 21.0分析，组间具有显著性差异（P＜0.05）。经对比分析数据，正常大鼠灌胃三黄泻心汤及其有效组分后0～2 h、4～10 h血清胆汁酸呈一定的降低趋势，TBA变化趋势整体比对照组平缓。其中：A组（大黄素+盐酸小檗碱+黄芩苷配比组）和B组（大黄素+盐酸小檗碱配伍组）在24 h内表现出相似的TBA变化趋势，而单独灌胃大黄素（C组）或中药复方三黄泻心汤（D组）大鼠后，TBA变化趋势与A组和B组变化有所不同，具体表现为6 h这个时间点呈升高趋势，且与空白组具有较大差异。D组（三黄泻心汤组）变化趋势较对照组最大，对TBA的降低作用表现最大。

3 讨论

3.1 三黄泻心汤及其有效组分对正常大鼠的总胆汁酸代谢影响

健康成人胆汁酸储存量大约为3～4 g。胆汁酸贮存库每天大约循环8～12次，主要发生在进餐后。人体每天胆汁酸合成量大约为0.4～0.6 g，用于补偿胆汁酸随粪便排出而造成的损失。有文献报道[10]，人体中血清总胆汁酸的变化是随不同时间变化而变化的。正常大鼠灌胃三黄泻心汤及其有效组分后24 h内血清TBA表现出组间差异，并总体表现出血清胆汁酸降低的趋势。在灌胃后2 h内，还有3 h、5 h、8 h、12 h这几个时间点表现出较大的差异，正常组表现为变化较大，而给药后TBA变化较平缓。这可能与三黄泻心汤及其有效组分可促进总胆汁酸的排泄有关。本课题后期将收集正常大鼠给药后24 h内粪便，进行TBA的检测分析，以确证这个猜想。

经对比分析数据，A组和B组在24 h内表现出相似的TBA变化趋势，在0～1 h、2～4 h、4～6 h、8～10 h与空白组具有较大差异；而单独灌胃大黄素或中药复方三黄泻心汤灌胃大鼠后，TBA变化趋势与A组和B组变化有所不同，具体表现为1～3 h、4～6 h、8～12 h与空白组具有较大差异。分析可能是因为灌胃不同药物对胆汁酸的影响造成血清TBA的变化，这对后期与胆汁酸代谢相关的疾病病理模型研究中时间点的选择和药物选择提供一定的依据。

3.2 三黄泻心汤及其有效组分对大鼠的总胆汁酸代谢影响具有临床指导意义

胆汁酸是胆固醇的最终产物并且是消除人体多余的胆固醇的主要途径之一。通过与多药转运蛋白的直接接触，胆汁酸可能受到药物转运的影响。胆汁酸是胆固醇的最终产物并且是消除人体多余的胆固醇的主要途径之一。已经有文献报道[11]，血清胆汁酸可通过激活特异性核受体调节葡萄糖、脂肪酸、脂蛋白的合成、代谢、转运和能量代谢。因此，本课题采用三黄泻心汤及其有效组分对正常大鼠血清TBA的代谢影响，可为后期的与胆汁酸相关的疾病或肝胆代谢性疾病的研究奠定一定的参考基础。

已经有学者[10]探究了正常人体血清TBA和7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮（7a-hydroxy-4-cholesten-3-one,C4）的昼夜变化规律，研究结果表明血清TBA在进餐后1 h和5 h浓度达到峰值，这与共轭胆汁酸变化规律一致；C4的变化与进餐无关，与昼夜节律相关，主要3 h和12 h达到峰值，这与非共轭胆汁酸变化规律一致。C4是由胆固醇生物化学合成胆汁酸的中间体。它的前体7α-羟基胆固醇由胆固醇通过肝胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）产生。血清C4浓度反映胆汁酸的合成途径。由于胆汁酸合成速率具有昼夜节律，因此血清C4值在一天中也变化。然而文献报道的胆汁酸变化时间节点与本课题中大鼠灌胃三黄泻心汤及其有效组分后血清TBA变化规律的内在联系需进一步的实验探索。