瘤毛獐牙菜愈伤组织诱导及生理生化特性研究

邹玉霞，马云桐，毛胜楠，钟芙蓉，申婵

瘤毛獐牙菜（Swertia pseudochinensisHara）为龙胆科獐牙菜属植物，主要野生分布于我国河北、吉林、辽宁、黑龙江等地。2015年版《中国药典》记载其以干燥全草入药，药材名为当药，具清湿热、健胃的功效，用于治疗湿热黄疸，胁痛，痢疾腹痛，食欲不振[1]。

商品主要来源于野生，近年来野生资源的急剧减少，不足以满足市场需求。关于瘤毛獐牙菜的组培快繁已有相关研究[2]，为了完善和优化瘤毛獐牙菜快繁体系的建立，本研究以瘤毛獐牙菜嫩茎和嫩叶为材料，采用L9(34)正交试验探索植物生长调节剂对瘤毛獐牙菜愈伤组织诱导的影响；并对诱导出的胚性与非胚性愈伤组织进行可溶性糖、可溶性蛋白含量及抗氧化物酶（SOD、POD、CAT）活性的测定，以期揭示愈伤组织诱导的潜在能力，为进一步建立愈伤组织的胚胎发生能力与生化代谢间的关系提供依据，为研究其体细胞胚胎发生奠定基础。

1 材料

1.1 外植体

供试品于2015年采自河北省承德市围场内健壮无病虫害的植株，经鉴定为瘤毛獐牙菜（Swertia pseudochinensisHara），选取成熟种子种于温室内，次年四月取其嫩茎及嫩叶为外植体。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 超净工作台（山东博科生物产业有限公司）、YH-JZ-Ⅱ接种器械灭菌器（上海宇涵生物科技有限公司）、GTOP系列智能光照培养箱（浙江托普仪器有限公司）、离心机（Hitachi centrifuge CT15RE）、全自动样品快速研磨仪（Tissuelyser-48上海净信科技）、96孔板、EP管、酶标仪（Thermo scientificTM varioskanTM FLASH）、移液枪（eppeudorf Research plus）等。

1.2.2 试剂 0.1% HgCl2；植物生长调节剂6-苄氨基嘌呤（6-BA）、2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D）、玉米素（ZT）；可溶性蛋白、可溶性糖、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）。

2 方法

2.1 外植体处理

取瘤毛獐牙菜嫩茎及嫩叶，流水下冲洗30 min，置于超净工作台上。用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次；0.1% HgCl2溶液浸泡5-6 min，无菌水冲洗5次，获得无菌嫩茎嫩叶。

2.2 愈伤组织的诱导

2.2.1 瘤毛獐牙菜愈伤组织诱导培养基 以MS为基本培养基；植物生长调节剂2, 4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）分别为A、B和C 3因素，每个因素各取3水平，应用正交表L9(34)设计不同因素水平配比的培养基（表1）；加入30 g/L 白糖和4.5 g/L琼脂；pH值调至5.8～6.0；在121℃、1.1 kg/cm2的高压灭菌锅下灭菌30 min。

表1 愈伤组织诱导L9(34)正交设计

2.2.2 接种培养与观察 在无菌条件下，将嫩茎剪成0.5-1 cm的小段，叶片剪成0.5 cm2的小块分别接入含有不同激素培养基的组培瓶中，培养条件分别为A（光照）：（25±1）℃、光照强度1500 lx、光照时间10 h/d；B（黑暗）：（25±1）℃、黑暗条件。

以上每个处理10瓶，每瓶8个接种点，每7 d观察一次并做记录，40 d统计诱导率，中途长菌的不计入最终结果。

愈伤组织诱导率（%）＝产生愈伤组织的外植体数/接入的外植体数

2.3 不同愈伤组织的生理生化研究

以继代40 d后的瘤毛獐牙菜胚性愈伤组织（embryogenic callus， EC）和非胚性愈伤组织（non-embryogenic callus ，N-EC）为材料，按照试剂盒说明书分别测定两者中可溶性糖、可溶性蛋白含量以及过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性并比较分析。

2.4 数据处理与分析

采用Microsoft excel 2013对实验数据进行统计绘图，SPSS 22.0软件进行方差分析和差异显著性检验。

表2 瘤毛獐牙菜愈伤组织诱导率

3 结果与分析

3.1 瘤毛獐牙菜愈伤组织诱导率及外植体形态变化

表3 瘤毛獐牙菜愈伤组织的形态变化

3.1.1 不同外植体及光照对愈伤组织生长的影响 结合表2及表3可知：嫩茎和嫩叶作为外植体均能诱导出愈伤组织，当仅从诱导率上观察，同等条件下，嫩茎诱导率大多高于嫩叶诱导率。以愈伤诱导率、愈伤形态及愈伤形成时间作为评判指标时，嫩茎更适宜做外植体。对比光照及黑暗条件，发现黑暗条件下愈伤组织生长速度较快，出愈时间较早。

3.1.2 植物生长调节剂对愈伤组织生长的影响

表4 极差分析与方差分析（根据光照条件下嫩茎诱导率）

结合不同外植体及光照条件考察结果，对表2中瘤毛獐牙菜的愈伤组织诱导率进行极差及方差分析，结果如表3所示。2，4-D、6-BA 和ZT 3个因素对瘤毛獐牙菜愈伤组织诱导率的影响均不显著，但影响程度略有差异，3种激素对愈伤组织诱导率的影响依次为B(6-BA)＞A（2，4-D）＞C（ZT）。2,4-D、6-BA和ZT 3因素及其质量浓度水平最佳组合为B3A2C3，即MS＋6-BA1mg/L+2,4-D2 mg/L+ZT0.9 mg/L为瘤毛獐牙菜愈伤组织诱导的最佳培养基。

3.2 胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织的生理生化研究

将愈伤组织转接入筛选出的最佳培养基中，随着愈伤组织的生长，发现其出现了两种不同类型。一种呈浅白色或白色，半透明，粘质状，具分化能力，在培养后期分化出胚状体，这种愈伤组织为EC；另一种呈黄色或浅黄色，半透明，结构疏松，表面粗糙或呈结晶状，继代培养之后只发生体积上的扩增，而没有胚状体的分化，这种愈伤组织为N-EC。其中EC具有再生潜能，在适宜的条件下可继续分化成具胚胎发生能力的胚状体；而N-EC难以分化成功，再生成植株的可能性也较小[3,4]。这2种类型的愈伤组织通常根据其形态、颜色便可加以区别[5,6]。对这两种愈伤组织分别进行可溶性糖、可溶性蛋白及CAT、SOD、POD的测定。

3.2.1 蛋白质含量与可溶性糖含量

图1 不同类型愈伤组织蛋白质和可溶性糖含量差异

瘤毛獐牙菜EC和N-EC的蛋白质、可溶性糖含量测定结果如图1所示，结果表明EC的蛋白质与可溶性糖含量分别为41.11 mg/g、15.91 mg/g，均显著高于N-EC中的含量。

3.2.2 抗氧化酶（CAT、SOD、POD）活性

表5 不同愈伤组织抗氧化物酶活性及t检验

瘤毛獐牙菜EC与N-EC中CAT、SOD、POD活性测定结果及使用两独立样本t检验其差异显著性结果如表4所示，结果表明EC中的CAT活性显著高于N-EC；SOD活性低于N-EC，但未达到显著性水平；POD活性显著低于N-EC。

4 讨论与结论

李茜茹[2]等人以瘤毛獐牙菜嫩茎为外植体对其组织培养及无性系建立进行了初步研究，本研究在其基础上对培养基及培养条件进行了进一步的优化和完善，并根据愈伤组织的形态将其分为了胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，同时测定了两种愈伤组织内抗氧化酶活性和可溶性糖、可溶性蛋白含量，揭示了两种不同愈伤组织的生理状态，为进一步分化和发育成苗提供指导意义。

4.1 本实验对瘤毛獐牙菜愈伤组织诱导条件进行优化结果表明：黑暗条件有利于愈伤组织的形成，嫩茎相比嫩叶更有利于愈伤组织的形成且胚性组织较多。王荣明[7]、付伟[8]等在研究不同因素对南方红豆杉以及中华卷柏愈伤组织诱导的影响时发现，光照对愈伤组织的形成有抑制作用，暗培养可以在一定程度上减轻愈伤组织的褐变，与此实验结果相吻合。在愈伤诱导阶段，ZT、6-BA、2，4-D发挥了不同的作用，MS＋6-BA1mg/L+2,4-D2 mg/L+ZT0.9mg/L为瘤毛獐牙菜愈伤组织诱导的最佳培养基。

4.2 通过对瘤毛獐牙菜EC与N-EC生理生化指标的测定，发现EC中可溶性糖及蛋白质均显著高于N-EC，表明EC代谢旺盛，蛋白质合成活跃，为后期细胞的分化做准备。本实验结果与孟姣等[9]在栓皮栎胚性和非胚性愈伤组织生化特性研究中的报道一致。这在后续快繁体系的建立中，对培养基的选择提供了参考依据。

4.3 抗氧化酶类物质活性测定结果显示，EC中CAT的活性显著高于N-EC，表明EC生理代谢强，清除自由基能力高，活力旺盛；EC与N-EC中SOD差异不明显；N-EC中POD高于EC，POD是木质素合成代谢中的关键酶，其含量与木质素合成的量成正相关，而木质素在细胞壁中有支撑细胞强度的作用[10]。从形态特征可见，N-EC结构致密，不易分散，表明N-EC细胞壁形成的木质素与POD有关。