EHD2在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义

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(南华大学附属第一医院耳鼻咽喉科，湖南 衡阳 421001)

喉癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全身肿瘤中占比1%～5%，在耳鼻咽喉头颈外科的恶性肿瘤中位居第三，仅次于鼻咽癌[1-2]，喉癌发生主要源自喉部黏膜上皮细胞，喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)是喉癌最为常见的病理学类型[3]。目前关于喉癌发生、发展的病因和机制尚未完全阐明，以往的研究发现原癌基因被激活、抑癌基因被抑制、EB病毒感染、吸烟、环境污染等相关因素在喉鳞癌的发生发展中都有一定的影响[4-5]。EHD家族蛋白2(Eps15 homology domain containing 2, EHD2)是一种膜转运调控蛋白，目前研究已发现EHD2在食管癌、乳腺癌、肝细胞癌和神经胶质瘤等多种肿瘤中表达下调，其作为一种抑癌基因参与肿瘤的发生发展[6-9]。目前EHD2在喉癌中的研究在国内外尚未见报道。本研究采用免疫组化法检测EHD2在喉鳞状细胞癌中的表达水平，并探讨其临床意义和Ki-67的关系，为将来喉癌的防治开拓新思路和提供新的潜在治疗靶点。

1 资料与方法

1.1研究材料收集2012年1月～2016年6月期间南华大学附属第一医院的喉鳞癌患者的石蜡包埋标本50例，各患者均接受手术治疗且有完整病理档案资料；并收集同一医院2017年1～12月期间手术切除的声带息肉标本50例。喉鳞癌患者女性2例，男性48例，年龄41～85岁(平均58.3岁)。声带息肉患者女性23例，男性27例，年龄29～69岁(平均48.8岁)。所有喉癌患者均由病理确诊为喉鳞状细胞癌，且临床病史资料收集完整，所有患者在术前均未接受过放化疗和其他特殊治疗，在术后都完善了跟踪随访，随访时间2～5年，其随访中位数2.3年(0.8年, 6.3年)，患者的生存时间以手术日期为起始点。在喉鳞癌中，声门型25例，声门上型15例，声门下型10例；TNM分期(UICC2002)Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期18例；不伴淋巴结转移38例，伴淋巴结转移12例；低分化13例，高中分化37例。

1.2方法喉鳞癌组织石蜡切片均由南华大学附属第一医院病理科提供。声带息肉组织组标本经4%多聚甲醛固定24 h，送至南华大学病理教研室进行石蜡包埋、脱水，再连续切片(厚度约为 4 μm)。按SP试剂盒(北京中杉金桥公司)说明书执行操作流程，石蜡组织切片经过常规脱蜡水化，柠檬酸钠抗原修复液(0.01 mol/L)进行抗原修复，冷却后PBS冲洗，3%过氧化氢液浴洗封闭内源性过氧化物酶。PBS冲洗后滴加稀释的EHD2和Ki-67抗体(1∶100，美国Proteintech公司)，孵育后PBS冲洗；滴加反应增强剂后孵育，PBS冲洗；滴加适量的增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，孵育后PBS冲洗；DBA显色剂(北京中杉金桥公司)显色，复染、分化、冲洗，脱水干燥、透明、封片，光学显微镜下观察。采用双盲法读片，EHD2、Ki-67分别以细胞质(或细胞膜)和细胞核中有棕黄色或棕黄色颗粒标志为阳性细胞。每张组织切片观察5个高倍视野(200倍或400倍)，并都随机计数200个肿瘤细胞。EHD2依据阳性细胞百分率和着色强度评分(0～3分)综合评定。最终根据综合评分定为两个等级：≥2分为阳性、高表达，<2分为阴性、低表达[8]。Ki-67依据阳性细胞百分率将其分为四个等级(I～IV级)，并综合评定：I级～II级评为阴性和低表达，III级～IV级评为阳性和高表达[2]。

1.3统计学处理本研究数据采用SPSS19.0统计软件进行数据的处理和分析，计数资料组间比较采用χ2检验，EHD2、Ki-67间的表达关系分析用Spearman法检测。5年总生存率用Kaplan-Meier方法进行分析并绘制生存曲线。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EHD2在喉鳞癌及声带息肉组织中的表达情况EHD2阳性表达主要被显示在细胞膜和细胞质中，呈棕黄色(图1)。喉鳞癌组织50例中，阳性或强阳性17例，阳性率为34%(图1B)，而对应的声带息肉组织50例中，阳性或强阳性34例，阳性率为68%(图1A)。EHD2在喉鳞癌组织中的表达水平低于声带息肉组织(χ2=11.565,P=0.001)。而Ki-67的表达情况与EHD2相反(图2)，Ki-67蛋白在喉鳞癌组织中阳性率62%(31/50)，在声带息肉组织中阳性率22%(11/50)，两者差异有显著性(χ2=16.420,P=0.001)。

2.2喉鳞癌组织中EHD2的表达与临床相关参数的关系EHD2在38例不伴淋巴结转移的喉鳞癌中，有16例阳性表达，而在12例有转移淋巴结的喉鳞癌中，有1例阳性表达，表达率分别为42.1%(16/38)、8.3%(1/12)，无转移组阳性表达率明显较高，其差异有统计学意义(χ2=4.635,P=0.031)，表明喉鳞癌EHD2的表达水平与有无淋巴结转移相关。在高中、低分化喉鳞癌组织中EHD2阳性表达率分别为43.2%(16/37)、7.7%(1/13)。随着分化程度越低，阳性表达率越低(χ2=5.418，P=0.020)。EHD2的表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤部位、TNM分期均无明显相关性(P>0.05)，见表1。

2.3喉鳞癌组织中EHD2与Ki-67表达的关系采用Spearman法分析喉鳞癌组织中EHD2与Ki-67表达的相关性，结果显示，两种蛋白表达明显呈负相关(r=-0.382，P<0.01)，见表2。

图1 EHD2在喉鳞癌组织及声带息肉 组织中的表达(SP 200×)A：在声带息肉组织中阳性表达；B：在喉鳞癌组织中阳性表达； C：在声带息肉组织中阴性表达；D：在喉鳞癌组织中阴性表达

图2 Ki-67在声带息肉组织和喉鳞癌 组织中的表达(SP 400×)A：在声带息肉组织中阴性表达；B：在喉鳞癌组织中阳性表达

2.4 EHD2表达水平和喉鳞癌预后的相关性50例喉鳞癌患者共完成随访45例(失访率10%)，采用Kaplan-Meier方法进分析5年总生存率，结果显示，EHD2阳性组患者的生存率为82.3%(14/17)，而阴性组为42.8%(12/28)，EHD2高表达组的患者生存率明显高于低表达组(χ2=6.010，P=0.014)。其生存曲线见图3。

表1 EHD2的表达与喉鳞癌临床相关参数的关系

表2 EHD2和Ki-67在喉鳞癌中表达相关性

图3 EHD2表达水平和喉鳞癌患者预后的相关性

3 讨论

目前喉癌的治疗主要采取以手术为主，放化疗联合的综合治疗方案[10]，但整体治疗情况仍不容乐观，且大多数患者术后声音嘶哑、甚至失声，生存质量仍欠佳，目前尚无一种令人满意的治疗方案[3,5]。喉癌的发生、侵袭、转移等一系列演变过程，不是单一因素所致，是由一系列癌基因、抑癌基因及环境因素共同触发而介导的复杂进程[11]。因此，寻找和探索新基因的功能对明确喉癌的发生发展机理有着重要意义。

胞吞作用可通过调控细胞的核信号、核转录和成瘤性从而促进肿瘤的发生发展[12]。EHD2作为新发现的膜转运蛋白，与EHD1、EHD3和EHD4共同组成EHD蛋白家族亚类[13]，在其C端包含EH域(Eps 15 homology domain)，由543个氨基酸残基构成，可通过连接不同的蛋白而发挥相应的作用，其主要功能是作为膜内吞调控蛋白，参与调节吞噬作用[13-14]。它可调节多种人体组织中多类受体，从而调节各种生理过程，如调节肌动蛋白细胞骨架、小GTP酶和多种膜受体，从而使相应配体转运至质膜[15-16]。EHD2在多种恶性肿瘤中被发现存在异常表达，在食管鳞状细胞癌中发现其高表达可以抑制肿瘤的发生发展[17-18]。在乳腺癌表达水平随着其肿瘤病理学分级的升高而逐渐降低，与其不良预后密切相关[19]。

本研究采用免疫组化方法发现EHD2可能与喉癌的发生发展密切相关，并分析EHD2表达情况与各临床相关参数之间的关系，发现EHD2表达水平与肿瘤组织分化、淋巴结转移呈负相关，生存率分析发现EHD2高表达患者较低表达者生存率高。本研究EHD2与Ki-67在喉鳞癌组织中的表达呈负相关，EHD2可以穿梭至细胞核抑制转录，并且已有报道在前列腺癌中EHD2缺失可以促进肿瘤细胞的增殖，与本研究结果基本一致。提示EHD2是喉癌潜在抑制因子，但其具体机制尚需进一步实验研究验证。综上所述，本研究EHD2在喉鳞癌及声带息肉组织中的表达具有差异性且与喉癌预后相关，提示其对于喉癌预后判断有一定帮助，是喉癌治疗的潜在治疗靶点，但相关的分子机制仍有待进一步研究。