干细胞动员对肺损伤大鼠模型肺功能保护及机制研究

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(南京医科大学附属淮安第一医院老年科,江苏 淮安 223300)

肺损伤是由于受到肺内外某些因素直接或间接的损伤肺血管内皮细胞或者肺泡的上皮细胞，使肺部的血管通透性增加，导致中性粒细胞浸润，释放炎症因子，引起组织损伤[1-2]。近年来对干细胞的研究和应用成为许多疑难杂症，如缺血性疾病，肺、脑损伤的有效治疗方式。在稳定状态下人类外周血中存在很低水平的干细胞并且大多处于静息状态，在炎症后其可迁移至非造血器官。在应急反应发生时，一些应急信号，如注射粒细胞集落刺激因子，会增加干细胞的释放，对受损的组织进行恢复。粒细胞集落刺激因子是目前最常用，效果明显的干细胞动员剂之一，在受损组织的恢复功能中发挥着重要作用[3]。本文通过皮下注射重组人粒细胞刺激因子治疗博来霉素诱导的肺损伤大鼠模型，探讨了干细胞动员对肺损伤大鼠的保护作用及其机制，为干细胞动员防治肺损伤提供理论依据。

1 材料和方法

1.1材料与试剂实验动物：雄性wistar大鼠30只，体质量(200±20)g,购自河北医科大学动物实验中心。实验中有关实验动物的喂养及处理均符合《关于善待实验动物的指导性意见》及《实验动物伦理学》的相关规定。

主要试剂：博来霉素(日本化药株式会社)；重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)(齐鲁制药)；戊巴比妥钠 (天津市化学试剂六厂)；4%多聚甲醛固定液(上海歌凡)；苏木精-伊红染色液(北京索莱宝)；肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒(中国武汉博士德生物工程有限公司)；白细胞介素(IL)-1βELISA试剂盒(中国武汉博士德生物工程有限公司)；白细胞介素(IL)-6 ELISA试剂盒(中国武汉博士德生物工程有限公司)。

主要仪器：光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；分光光度计(上海第三分析仪器厂)；多样品组织研磨机-24(天津科莱恩)；多功能酶标仪(美国Bio-Rad公司)；低温高速离心机(美国Thermo公司)；-80℃冰箱(海尔)；注射器等。

1.2实验分组及模型的建立[4]雄性wistar大鼠30只，随机分为正常组、对照组和动员组各10只。正常组正常饲养，不做处理，对照组、动员组大鼠经气管注入5mg·kg-1博来霉素0.2～0.3mL 诱发建立肺损伤模型，大鼠明显出现呼吸加快,浅促。动员组于模型建立后即刻皮下注射重组人粒细胞刺激因子30μg·kg-1·d-1，连续7天；对照组于模型建立后即刻皮下注射等量生理盐水，连续7天。7天后注射3%戊巴比妥钠1mg·kg-1过度麻醉处死。

1.3观察肺组织病理改变取部分右肺下叶用多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm切片，HE染色，显微镜下观察病理改变。

1.4肺泡灌洗液中性粒细胞数测定取部分右肺以10mL生理盐水灌洗3次，收集灌洗液，离心800r·min-1，5min，收集上清液放入-80℃冰箱保存。

1.5肺组织的湿干比测定取右肺上叶组织以生理盐水冲洗表面血液，用滤纸吸干肺脏表面附着液体，称质量为肺湿质量，在80℃烘箱中干燥过夜，再次称质量为肺干质量，计算两次肺组织质量之比，即肺组织的湿干比。

1.6肺组织匀浆中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、白细胞介素(IL)-6的测定取大鼠左肺组织按1g肺组织加5mL生理盐水比例制成匀浆，行ELISA法检测肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，严格按照试剂盒的说明书操作。

2 结果

2.1肺组织病理学改变正常组肺泡结构清晰，间隔完整；对照组肺泡结构破坏，间隔增厚，有炎性细胞浸润；动员组肺泡结构清晰，但较正常组间隔仍增厚，肺组织损伤明显减轻。

图1 A、B、C分别为各组大鼠肺组织HE观察结果(200×)注：A为正常组，B为对照组，C为动员组。

2.2各组大鼠肺泡灌洗液中性粒细胞数和肺组织湿干比的差异比较与正常组相比，动员组和对照组肺泡灌洗液中性粒细胞数均高于正常组(P<0.05)，对照组的肺组织湿干比高于正常组(P<0.05)；与对照组相比，动员组肺泡灌洗液中性粒细胞数和肺组织湿干比均低于对照组(P<0.05)。

表1 各组大鼠肺泡灌洗液中性粒细胞和肺组织 湿干比的差异比较

与正常组比较，aP<0.05；与对照组比较，bP<0.05

图2 各组大鼠肺泡灌洗液中的中性粒细胞数

图3 各组大鼠肺细胞湿干比

2.3各组大鼠肺组织匀浆中细胞因子含量检测结果与正常组相比，对照组的肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1、白细胞介素(IL)-6的表达水平均高于正常组(P<0.05)；与对照组相比，动员组TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。

表2各组大鼠肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平比较(pg/mL)

分组nTNF-αIL-1βIL-6正常组10108.33±13.78208.93±13.02127.34±11.46对照组10365.79±26.02a532.61±20.37a386.76±15.26a动员组10145.36±9.27b304.05±15.96ab187.83±12.58b

注：与正常组比较，aP<0.05；与对照组比较，bP<0.05

图4 各组大鼠肺组织匀浆中炎症因子水平

3 讨论

肺损伤，就是指肺部的损伤，有各种表现，是一个复杂的过程，涉及到许多细胞活动，分为早期的组织损伤和晚期的损伤后恢复[5]，初步认为肺损伤是以血管为中心的，以中性粒细胞、巨噬细胞等等反应为主的炎症过程[6]，而TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子在这一过程中发挥着重要作用[7]。用博来霉素诱导的肺损伤模型，起初主要的症状为破坏肺泡细胞，毛细血管壁通透性增加使炎性细胞因子浸润，之后转化为肺部纤维化，肺组织功能受损[8]。

目前治疗肺损伤的方法主要是呼吸维持及抗炎用药，但效果不是很好，而干细胞动员作为一种新的治疗方法受到了广泛关注。

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。近些年来，随着对干细胞分化潜能的研究，使干细胞在防治某些损伤性疾病和造血系统、免疫系统疾病中的治疗作用得到很大促进，并发现干细胞能修复受损肺组织的结构和功能。干细胞动员剂可以使骨髓造血细胞、内皮干细胞、充质干细胞同时动员，从而使骨髓的多种干细胞动员参与受损组织的恢复[9]，其中粒细胞集落刺激因子是骨髓干细胞最强的动员剂之一。当机体受损或有炎症时，单一或多重的应急信号可干扰稳态造血，导致骨髓中成熟和不成熟的造血细胞向外周循环的释放增加，骨髓释放干细胞至循环并迁移至损伤部位，来构成机体防御和组织修复。而肺内有多种干细胞，肺组织受损后由于内源性干细胞的存在使肺具有一定再生能力，外源性的干细胞也在受损组织处分化为肺功能细胞，具体机制还有待研究[10]。

正常生理条件下，机体的炎症因子处于动态平衡状态，当机体遇到刺激时平衡状态被打破，若炎性因子过表达，就会造成机体损伤。当发生创伤应激反应时，大量炎症因子产生如TNF-α、IL-1β、IL-6等，促进炎症反应，从而炎症级联反应放大，加重肺损伤。

TNF-α主要由单核细胞和巨噬细胞激活后产生，能直接损伤组织器官，在炎症的发生中起着起始作用而诱导其他炎性因子的释放。TNF-α可以使中性粒细胞大量释放，增加血管通透性，促使IL-1β、IL-6等炎性因子释放生成量增多，加重炎症反应的发生进程。白细胞介素由多种细胞产生，参与机体免疫调节应答，参与机体的生理病理过程，在干细胞动员中具有调节作用。IL-1β由多种类型细胞分泌，参与介导免疫和炎症反应，它能有效促进骨髓间充质干细胞向损伤组织迁移[11]。IL-1β也能促进TNF-α、IL-6的生成。IL-6可由多种细胞分泌，具有促进干细胞分化，刺激造血干细胞生长的功能，促进干细胞向受损的组织迁移，归巢，并转化为肺组织细胞[12]。

干细胞具有减轻炎症反应的功能，通过再生修复、免疫调节、抗凋亡抗氧化等[13]。研究表明，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子在肺损伤中明显增高，可通过增加肺泡毛细血管的通透性而增加肺组织含水量[14]。而移植的骨髓间充质干细胞可以向受损的组织聚集分布，抑制TNF-α、IL-1β等细胞因子的释放，减轻炎症反应修复肺组织，治疗重症急性胰腺炎肺损伤大鼠[15]。此前有研究报道研究发现皮下注射rhG-CSF进行骨髓干细胞动员能够使急性肺损伤大鼠的IL-1β和TNF-α等炎性因子的表达水平下调，进而阻止炎症反应的发生发展，进而促进肺组织损伤的修复。

肺组织湿干比，即肺水含量，被称为水肿的指标来进行评价，而水肿是炎症的典型表现。在本研究结果中，与正常组相比，对照组的肺组织湿干比高于正常组(P<0.05)；动员组肺组织湿干比均低于对照组(P<0.05)。肺损伤是一种全身炎症反应的表现，当发生病理炎症反应时会激活中性粒细胞的释放，导致促炎因子释放，扩大炎症级联反应，加剧损伤的发生发展。在本研究结果中，与正常组相比，动员组和对照组肺泡灌洗液中性粒细胞数均高于正常组(P<0.05)，与对照组相比，动员组肺泡灌洗液中性粒细胞数低于对照组(P<0.05)；肺组织匀浆中对照组和动员组TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平均明显高于正常组(P<0.05)，动员组低于对照组(P<0.05)，提示TNF-α、IL-1β、IL-6参与了肺损伤的病理过程，并且加剧的损伤的严重程度，而干细胞动员能有效保护肺损伤，具有一定的临床意义。

大鼠体内注入博来霉素可使肺组织受损，进而炎细胞浸润，TNF-α、IL等大量产生，本实验中在注射博来霉素后注射重组人粒细胞刺激因子，结果显示中性粒细胞数减少，肺组织湿干比降低，肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，表明干细胞动员可以抑制炎症反应，保护肺功能促使其恢复。干细胞其对受损组织再生修复的功能这一新的研究越来越受到广大学者的重视，相信不远的将来会有重大突破。