硝化应激参与同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞自噬降低

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(1.首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系，北京100069；2.首都医科大学附属 北京潞河医院病理科；3.代谢紊乱相关心血管疾病北京市重点实验室)

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是一种含硫氨基酸，当人体血浆Hcy水平高于10 μmol/L即被认为是高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia, HHcy)[1]。高同型半胱氨酸血症是心脑血管疾病的独立危险因素，参与并导致多种心血管疾病的发生发展[2]。血管内皮功能障碍是许多心血管疾病的发病基础及始动环节。有文献报道，HHcy能够通过炎症[3]、氧化应激[4]等机制导致严重的血管内皮损伤，最终导致动脉粥样硬化等疾病的发生。自噬是体内高度保守的生物过程，对于维持血管内皮细胞正常功能具有十分重要的作用[5-6]。有研究表明，Hcy能够损伤血管内皮细胞的自噬水平[7]，但其机制并不十分清楚。在作者前期的研究中发现，HHcy能够升高机体硝化应激水平，产生大量的过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite, ONOO-)等强氧化物质，导致严重的血管内皮损伤[8]。Hcy是否会通过升高硝化应激水平导致细胞自噬损伤呢？本研究拟探究硝化应激在Hcy降低血管内皮细胞自噬中的作用，为阐明HHcy导致血管内皮细胞损伤的机制提供新的思路和实验依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂3月龄雄性SD大鼠均由首都医科大学实验动物中心提供；大鼠血浆Hcy酶联免疫检测试剂盒(南京建成，中国)；胎牛血清、DMEM高糖培养基(Hyclone公司，美国)；Hcy试剂(Sigma-Aldrich公司，美国)；FeTMPyP试剂(Cayman Chemical公司，美国)；LC3抗体、p62抗体(CST，美国)、3-NT抗体(Millipore 公司，美国)；GAPDH抗体、山羊抗兔IgG/生物素标记和山羊抗小鼠IgG/生物素标记(Santa Cruz公司，美国)；兔/小鼠超敏二步法检测试剂盒购自北京中杉金桥公司；Western blot电泳仪，Western blot电转仪，凝胶成像系统(Bio-Rad公司，美国)。

1.2主要方法

1.2.1 HHcy大鼠模型构建及血浆Hcy浓度的检测

将SD大鼠随机分为正常饮食喂养组及2.5%蛋氨酸饮食喂养组，在喂养6个月后，酶联免疫法检测大鼠血浆Hcy浓度。实验操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 细胞培养及给药 含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM高糖培养基培养HUVECs细胞，置于95% O2和5% CO2培养箱37 ℃孵育。细胞贴壁后，隔天换液培养，当细胞密度达到70%～80%进行传代至6孔板继续培养。当6孔板细胞密度达60%～70%，给予细胞2.5 μmol/L FeTMPyP预处理30 min后，给予细胞500 μmol/L Hcy处理24 h。加药完成后提取细胞蛋白，进行后续实验。

1.2.3 免疫组织化学染色 将胸主动脉石蜡切片常规脱蜡至水后，用PBS漂洗；微波炉法进行组织抗原修复，当切片恢复至室温后，用5% BSA室温封闭20 min，甩掉封闭液，分别加入LC3、p62及NT抗体，4 ℃孵育过夜；次日，取出切片恢复至室温后，PBS冲洗，使用兔/小鼠超敏二步法检测试剂盒，室温孵育聚合物辅助剂、辣根酶标记抗小鼠IgG聚合物各30 min。镜下观察DAB显色液使切片显色情况，苏木精染液染色5 min使细胞核着色，使用1%盐酸酒精脱去非特异性染色。梯度乙醇二甲苯脱水，树脂封片，显微镜观察并拍照。

1.2.4 Western blot 取加药后HUVECs细胞蛋白用RIPA细胞裂解液进行裂解，并超声离心。取蛋白上清检测蛋白浓度。根据浓度配制10 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳以分离条带，后将蛋白转移至PVDF膜上，5%奶粉室温封闭1 h后孵育一抗，4℃过夜。洗膜后孵育二抗，ECL发光试剂曝光，得到显色条带。ImageLab软件分析条带灰度值。

1.3统计学分析数据分析采用SPSS 13.0统计软件，所有数据均用均数±标准差表示。组间的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HHcy大鼠模型建立成功和正常饮食喂养的大鼠相比，2.5%蛋氨酸饮食喂养6月组大鼠血浆Hcy浓度明显增加，表明HHcy大鼠模型建立成功(图1)。

图1 大鼠血浆Hcy浓度与Normal组比较，**P<0.01

2.2 HHcy大鼠胸主动脉自噬相关蛋白及硝化应激相关蛋白的检测对HHcy大鼠胸主动脉切片进行免疫组织化学染色并镜下观察，发现HHcy大鼠中硝化应激相关蛋白以及自噬相关蛋白表达均出现明显变化。由于ONOO-在体内的代谢途径复杂，并且反应十分迅速，因此很难直接测量体内ONOO-的浓度。目前，使用NT的单克隆抗体检测到硝基酪氨酸的存在，被公认为是体内ONOO-生成的印迹。结果显示，和正常大鼠相比，HHcy大鼠胸主动脉NT的表达明显增加，且集中在内膜，提示HHcy大鼠体内硝化应激水平呈明显升高的状态(图2A)。同时，检测自噬相关蛋白LC3发现，HHcy大鼠LC3表达有所降低，而作为自噬底物，p62的表达却明显升高(图2B)。提示HHcy大鼠胸主动脉自噬水平明显降低。

图2 HHcy大鼠胸主动脉NT、LC3及p62免疫组化染色A：大鼠胸主动脉NT的表达(20×)； B：大鼠胸主动脉LC3、p62的表达(20×)

2.3 Hcy对HUVECs硝化应激及自噬相关蛋白的影响为探究Hcy对HUVECs细胞自噬及硝化应激水平的影响，给予HUVECs细胞Hcy刺激(500 μmol/L，24 h)，并提取细胞蛋白，检测其浓度后进行Western Blot实验。结果显示，和对照组相比，Hcy刺激的HUVECs细胞NT表达明显增加(图3A)，提示Hcy刺激诱导HUVECs细胞硝化应激水平增加。而自噬相关蛋白LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达明显降低(图3B)；自噬底物p62的表达明显增加(图3C)，以上结果提示Hcy刺激HUVECs细胞自噬水平降低。

2.4 FeTMPyP能够逆转Hcy诱导的HUVECs细胞自噬降低为进一步探究Hcy诱导的硝化应激升高及自噬降低之间的关系，用ONOO-清除剂FeTMPyP对HUVECs细胞进行预处理，在预处理30 min后加入Hcy刺激24 h。Western blot结果显示，和Hcy(-)FeTMPyP(-)细胞相比，Hcy(+)FeTMPyP(-)处理的细胞NT表达明显增加，而FeTMPyP预处理的细胞能够逆转NT表达的增加，几乎降低至正常水平(图4A)，这提示FeTMPyP能够清除ONOO-，以降低细胞的硝化应激水平。同时，FeTMPyP预处理能够提高LC3表达(图4B)，同时降低p62表达(图4C)。这提示FeTMPyP能够逆转由Hcy引起的自噬水平降低。

图3 Hcy对HUVECs细胞NT、LC3 Ⅱ/Ⅰ及p62蛋白表达情况的影响A：Hcy刺激下HUVECs细胞NT的表达；B：Hcy刺激下HUVECs细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达； C：Hcy刺激HUVECs细胞p62的表达与Con组比较，**P<0.01

图4 FeTMPyP处理对Hcy刺激HUVECs细胞NT、LC3 Ⅱ/Ⅰ及p62蛋白表达情况的影响A：FeTMPyP处理对Hcy刺激HUVECs细胞NT表达的影响；B：FeTMPyP处理对Hcy刺激HUVECs细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ表达的影响； C：FeTMPyP处理对Hcy刺激HUVECs细胞p62表达的影响与Con组比较，**P<0.01

3 讨论

HHcy是心血管疾病的独立危险因素[2]。目前对于HHcy促进心脑血管疾病发生发展的机制研究尚不完全清楚。自噬作为哺乳动物体内高度保守的细胞自我保护机制，对于维持心脑血管功能的稳定具有十分重要的意义[9-10]。有文献报道，HHcy能够影响不同细胞的自噬水平。在本文作者前期研究中发现，Hcy能够通过激活mTOR通路降低乳鼠心肌细胞中的自噬水平[11]；也有文献报道，HHcy能够通过增强对神经细胞毒性作用过度提高神经元自噬水平，导致脑缺血后细胞死亡的发生[12]。已有文献表明，Hcy在低浓度时提高自噬水平，而高浓度的Hcy则抑制自噬水平[7]。造成这一现象的原因可能是当Hcy这一损伤因素存在时，细胞能够代偿性地提高自噬以抵抗损伤；高浓度Hcy的持续刺激造成累积的严重损伤，细胞处于失代偿，进一步促进损伤的发生。有研究表明，HHcy可能通过mTOR通路影响自噬水平[11,13]，而关于HHcy如何影响血管内皮细胞自噬的研究少之又少。

本研究通过免疫组织化学染色法以及Western blot技术检测了HHcy大鼠以及Hcy处理的HUVECs细胞中NT的表达水平，以及自噬相关蛋白的表达水平，分别在在体水平及离体水平验证硝化应激及细胞自噬的变化。结果表明，无论是HHcy大鼠的胸主动脉中还是Hcy处理细胞中NT的表达水平明显增加，NT被公认为是体内ONOO-生成的印迹，能够反映体内ONOO-的浓度及硝化应激的水平[14]。HHcy大鼠的胸主动脉及Hcy处理细胞中硝化应激水平明显增加，而自噬水平被明显抑制。为进一步验证HHcy通过提高硝化应激降低自噬水平，本文作者在给予细胞Hcy处理的基础上，加入ONOO-的清除剂FeTMPyP预处理细胞，以降低硝化应激水平。结果显示，FeTMPyP预处理组细胞能够明显降低NT的表达。更为重要的是，当FeTMPyP降低硝化应激水平后，进一步逆转了由Hcy引起的自噬降低。

综上，本研究表明HHcy可能通过升高硝化应激水平以抑制血管内皮细胞自噬水平，这可能是HHcy导致心脑血管疾病的重要机制之一。本研究完善了HHcy对细胞自噬调控的可能机制，为防治HHcy导致的血管内皮细胞损伤提供了新的思路和实验依据。