骨髓间充质干细胞移植对脑动脉栓塞大鼠VEGF165、 Notch1表达的影响

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(池州市人民医院神经外科，安徽 池州 247000)

动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)是指栓子沿血液循环进入脑动脉系统，引起动脉管腔闭塞，致使该动脉供血区局部脑组织的坏死。MCAO是威胁人类健康的一种疾病，近年来发现促进脑内血管生成是一种新的恢复脑梗死的治疗手段。骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)是具有自我更新能力的一种细胞，可以多向分化为机体的各种细胞，其在体外诱导可以分化为神经细胞[1]，在组织工程、基因工程、细胞移植方面有较好的临床应用前景，BMSCs移植是治疗脑血管疾病一种新的治疗方法。本实验通过建立大鼠脑动脉栓塞模型，观察BMSCs移植后脑组织微血管密度(micro-vascular density，MVD)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)165、Notch1的表达，来探究BMSCs促进血管新生的机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂实验动物：45只健康雄性SD大鼠，体质量(260±20)g；10只健康雄性SD大鼠，体质量(90±10)g，购自北京维通利华实验技术有限公司，许可证号SCXK(京)2011-0011。

主要试剂：胎牛血清、DMEM培养基、胰酶、双抗(Gibico，美国)；兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体(Preprotech，美国)；小鼠抗大鼠Notch1抗体(Chemicon，美国)；兔抗大鼠VEGF抗体(Preprotech，美国)；辣根过氧化物标记的羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；组织蛋白提取试剂盒(北京索莱宝)。主要仪器：光学显微镜(OLYMPUS，日本)；低温高速离心机(Thermo，美国)；PCR仪(ABI，美国)；微量移液器、培养瓶、培养皿等。

1.2 BMSCs的分离培养[2]取体重为(90±10)g SD大鼠，分离其两侧的股骨，以使骨髓腔充分暴露，用DMEM培养基反复冲洗后，将骨髓悬液过滤并离心，弃掉上清，将重悬的细胞移至培养瓶中于细胞培养箱中进行培养。培养24 h后弃掉没有贴壁的细胞，更换新的培养液。在此之后每3天进行1次换液，等到细胞生长融合达到80%～90%时传代培养。取第4代的细胞用于本实验研究来进行移植。

1.3 MCAO模型的建立线栓法制作MCAO模型[3-4]。将大鼠按照1 mL/100 g腹腔注射4%的水合氯醛麻醉。大鼠固定后，在颈部正中切口，分离暴露出右侧颈总、颈内和颈外动脉，结扎颈外动脉远心端、颈总动脉近心端，夹闭颈内动脉，在颈外动脉近心端剪一“V”形切口，将线栓插入距离颈总动脉18 mm处时固定，缝合皮下组织，1个小时后拔线，缝合切口。大鼠即刻出现右侧Horner征即为模型成功。

1.4 MCAO瘫痪程度评分动物麻醉清醒后，参照Zea Longa方法[3]，对神经功能缺损进行评分。1～3分者为纳入本实验研究对象，对于神经损伤太重(4分)或太轻(0分)的老鼠弃之不用。

1.5实验分组BMSCs移植组：模型制作成功24小时后，将第4代的BMSCs细胞3×106个混悬于0.6 mL磷酸盐缓冲液(PBS)，通过股静脉匀速注入。MACO组，24小时后股静脉匀速注入等量PBS。假手术对照组，只切开颈部皮肤暴露动脉，不插线栓，24小时后股静脉匀速注入等量PBS。各组再按不同时间点随机分为3组，每组5只。BMSCs移植后4天、7天、14天取材。

1.6 MVD检测随机选择各组各时间点脑组织冰冻切片5张，按照免疫荧光染色法Ⅷ因子检测法，每单个内皮细胞或内皮簇为一个血管计数，每个标本取2～3张切片，荧光显微镜下对微血管进行计数。用均值来作为微血管密度。

1.7 Western blot检测VEGF165、Notch1蛋白表达

严格按照试剂盒说明书进行操作来提取各组大鼠脑组织中的总蛋白，并进行蛋白定量。分别制备浓缩胶与分离胶，加样后行蛋白电泳、电转移，5%脱脂奶粉封闭后，加入相应一抗兔抗大鼠VEGF抗体、小鼠抗大鼠Notch1抗体(稀释倍数为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜、洗膜后加入二抗(稀释倍数为1∶2 000)37 ℃孵育2 h，清洗后于暗室中滴加化学发光液显影，于凝胶成像系统采集图像。以β-actin蛋白作为内参，各组目的条带灰度值与内参进行比值为蛋白的表达相对量。

1.8 RT-PCR检测VEGF165、Notch1 mRNA表达取大鼠脑组织提取总RNA，于PCR仪中行逆转录，按照预先设定荧光定量PCR反应程序进行扩增，行琼脂凝胶电泳，用凝胶成像分析系统对电泳条带的吸光度(OD值)半定量分析。结果以目的基因的OD值比上β-actin的OD值来表示。

2 结果

2.1 BMSCs形态学变化原代培养的细胞呈圆形，1天后即开始贴壁生长，3天后可见细胞呈成纤维样，5天时细胞生长增加，10天左右细胞生长达到80%～90%融合，细胞呈长梭形。传代后，细胞增殖速度加快，随着传代代数的增加，细胞形态多逐渐趋于一致较均一为长梭形，并呈漩涡或束状排列生长(图1)。

图1 骨髓间充质干细胞的形态学观察(200×)A：原代培养的细胞；B：呈成纤维样生长的贴壁干细胞； C：细胞生长达到80%～90%；D：第4代干细胞

2.2各个不同时间点大鼠脑组织MVD分析在假手术组微血管计数几乎很少，MCAO组、BMSCs组微血管数量显著高于假手术组(P<0.05)，BMSCs移植后新生血管数量明显增多(P<0.05，表1)。

表1 大鼠脑组织不同时间微血管计数

与假手术对照组，aP<0.05；与MCAO组，bP<0.05

2.3 Wsternblot检测VEGF165、Notch1蛋白的表达MCAO组、BMSCs组在各个时间点VEGF165、Notch1蛋白表达均明显高于假手术对照组(P<0.05)，BMSCs移植后，表达更高(P<0.05)，在第14天各组蛋白表达开始下降(图2、表2)。

图2 各组大鼠不同时间点VEGF165、Notch1蛋白的表达

分组VEGF1654天7天14天Notch14天7天14天假手术对照组0.019±0.0020.019±0.0030.018±0.0030.014±0.0020.014±0.0040.016±0.003MCAO组0.156±0.007a0.189±0.011a0.121±0.007a0.145±0.008a0.186±0.010a0.130±0.007aBMSCs组0.214±0.013ab0.298±0.014ab0.175±0.006ab0.202±0.012ab0.345±0.014ab0.183±0.008ab

与假手术对照组，aP<0.05；与MCAO组，bP<0.05

2.4 RT-PCR检测VEGF165、Notch1 mRNA的表达

MCAO组、BMSCs组VEGF165、Notch1 mRNA表达均明显高于假手术对照组(P<0.05)，BMSCs移植后表达更高(P<0.05，表3)。

表3 各组大鼠不同时间点脑组织VEGF165、Notch1 mRNA的表达(n=5)

与假手术对照组比较，aP<0.05；与MCAO组比较，bP<0.05

3 讨论

脑栓塞有较高的发病率及致死率，会导致神经功能损害，随着对干细胞移植这一领域的研究越来越多，为治疗脑动脉栓塞提供了新的治疗手段。BMSCs来源充足，生物特性稳定，易于传代培养，可以分泌大量促血管生长因子[5]。BMSCs移植可以通过组织渗透、减少细胞凋亡、分泌细胞因子、减少炎症反应等许多途径而作用于神经系统，对受损组织发挥修复与保护的作用[6]。BMSCs具有多向分化的功能，有研究表明BMSCs移植可以迁移到病变部位，分化为神经细胞，改善脑梗死模型大鼠的神经功能[7]。BMSCs移植对脑缺血损伤具有恢复、保护作用，其作用机理可能是通过增加神经细胞数量与神经因子表达来实现[8]。

血管新生是指血管内皮细胞在血管生成因子的作用下形成新生血管，血管发生密度改变决定了脑梗死后神经元存活与否，同时也是干细胞移植成功与否的关键性因素[9]。本实验通过股静脉注射将BMSCs移植到MCAO大鼠模型体内，通过促进栓塞区血管新生降低神经功能的损失。本研究发现栓塞区脑组织血管新生明显多于对照组，BMSCs组有大量微血管生成，提示可能是VEGF表达上调，随着时间延长，数量增加，在第14天时数量开始下降，进一步Westernblot、PCR实验也证明了这一推论。

目前广大学者认为与血管新生密切有关的是VEGF和Notch信号通路。病理条件下，Notch信号通路与血管形成密切相关，而VEGF可以通过Notch信号通路发挥生理作用，促进血管生成[10-11]。VEGF是特异性促血管生成因子，对血管新生的起始具有关键性作用，其中VEGF165的作用最明显。MACO动物模型显示，MACO后24小时血管内皮细胞开始明显增生[12]，在本实验中，BMSCs移植到脑栓塞大鼠体内后发现VEGF165蛋白、mRNA相较于假手术对照组明显升高，说明BMSCs移植能够通过增加VEGF165的表达从而促进血管新生。

研究发现，许多信号通路参与了血管新生的过程，其中Notch信号的调节作用尤为突出[13]，另外，Notch信号激活可以促进BMSCs移植作用，使心肌梗死区BMSCs向内皮细胞分化,促进缺血心肌中毛细血管新生[14],此外还对一些组织的血管生成具有调控作用[15]。在本实验中，BMSCs移植到脑栓塞大鼠体内后发现Notch1蛋白、mRNA相较于假手术对照组明显升高，表明BMSCs移植后可能通过激活Notch信号通路而促进脑动脉栓塞组织中VEGF165的表达，从而促进形成新生的血管[2]。

组织器官缺血后VEGF和Notch信号通路均与血管新生有着密切关系。VEGF能刺激血管的新生，是血管生成的重要因素，VEGF表达增加激活Notch信号通路。本实验检测了脑栓塞组织区的VEGF165蛋白、mRNA与Notch1蛋白、mRNA，结果显示，MCAO组、BMSCs组VEGF165蛋白、mRNA与Notch1蛋白、mRNA表达较假手术对照组明显升高。表明Notch信号通路可以促进BMSCs分化，提示VEGF调控血管生成过程中，Notch信号通路也参与血管新生，起着重要调控作用。

综上所述，BMSCs移植可对脑动脉栓塞大鼠有很好的治疗效果，能够使BMSCs在栓塞区存活，加快促进血管新生，提高VEGF、Notch表达，激活VEGF/Notch通路，促进受损神经功能的恢复，在一定程度上保护了脑组织，为临床治疗脑栓塞提供了新的治疗方法。但VEGF/Notch通路在BMSCs移植促进脑微血管形成中的具体机制需要广大学者的进一步探索。