人脐带间充质干细胞对急性肺损伤大鼠的血清炎性 因子及肺组织TRB3 mRNA表达

(南京医科大学附属淮安第一医院新生儿科,江苏 淮安 223300)

急性肺损伤是呼吸内科常见病、多发病，其是由意外创伤、微生物感染、化学试剂等引起的，以进行性呼吸困难、肺组织急性病变为主要临床表现的肺部疾病[1]。研究表明急性肺损伤时,体内多种炎症因子激活，进一步加重肺部损伤[2]。目前关于急性肺损伤尚未发现有效治疗手段，患者往往预后不良。干细胞具有较强的分化潜能，能修复多种组织损伤[3]，急性肺损伤时肺组织内血管内皮、肺泡壁组织、肺泡毛细血管屏障均遭到破坏，体内白细胞介素6(interleukins-6，IL-6)、白细胞介素10(interleukins-10，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TGF-α)等炎症因子水平显著升高，促进炎症反应、引起细胞程序性凋亡[4]。研究表明TRB3参与细胞凋亡及炎症反应[5]，且TRB3与急性肺损伤相关研究较少，本研究旨在探究研究人脐带间充质干细胞对急性肺损伤大鼠的血清炎性因子及肺组织TRB3 mRNA表达影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物 60只SD大鼠由长沙天勤生物技术有限公司提供，许可证号：scxk(湘)2014-0010，周龄4～6周，体重160～180g。将大鼠饲养在温度21～25℃，湿度45～55%的空调房内，保持12小时昼夜节律，并保持提供充足的水和食物。

1.1.2 人脐带间充质干细胞 人脐带间充质干细胞来源于我院第一附属医院妇产科健康新生儿，产妇及家人均签署之情同意书，并通过医院伦理委员会批准。

1.1.3 主要试剂 DMEM/F12培养基(hyclone)、胰酶(碧云天)、胎牛血清(Thermo Fisher公司，货号：10099158)、脂多糖(LPS)(Solarbio公司货号：L8880)、白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子试剂盒(南京信帆生物技术有限公司)、逆转录试剂盒( 美国ThermoFisherScientific公司)、实时荧光定量PCR试剂盒(Sigma-Aldrich)等。

1.1.4 主要仪器 SimpliAmpTMPCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)、低温高速离心机(Hermel公司)、PCR Lightcycler 480 仪器(罗氏诊断产品有限公司)等。

1.2方法

1.2.1 实验动物分组及疾病模型构建[6]60只SD大鼠随机分为以下3组(每组20只)：正常对照组，急性肺损伤模型组，干细胞治疗组，饲养1周适应环境后，鼠尾消毒后急性肺损伤模型组和干细胞治疗组鼠尾注射LPS(3 mg/kg)，正常对照组鼠尾注射同等体积生理盐水，成模标准：12小时后，大鼠呼吸频数增加，，出现呼吸窘迫，动脉血氧分压/吸氧浓度<300mmHg即为造模成功。成模2小时后，C组予以气管内滴注人脐带间充质干细胞悬液0.1 mL(细胞溶液浓度2×107个/mL)，正常对照组、急性肺损伤模型组予以同体积生理盐水滴注。

1.2.2 人脐带间充质干细胞 人脐带间充质干细胞来源于我院第一附属医院妇产科健康新生儿，产妇及家人均签署之情同意书，并通过医院伦理委员会批准。胎儿脐带去除动静脉，PBS清洗后，手术剪剪碎脐带至于15mL离心管内，向管内加入胶原酶3mL，静至30min后，加入0.25%胰酶摇床上震荡60 min加入培养基2 mL，去除肉眼可见大体积团块，用80目细胞筛过滤2次后，将滤液装入另一15mL离心管，2500 r/min离心15分钟，弃去上清液。将细胞悬液至于配置好培养基内，扩增至第5代后用于气管内滴注。

1.2.2 各组血清炎性因子水平测定 在造模成功并气管滴注干细胞24小时后，抽取大鼠右侧股静脉血液2～5mL,将血液样本标记后静置2 h，2000r/min离心10分钟后，取上清液，置于-20℃待用。血清白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子(TGFα)水平采用ELISA法测定，操作步骤严格遵循测试盒说明书。

1.2.3 各组肺组织TRB3 mRNA表达量测定 在造模成功并气管滴注干细胞24小时后，每组取3只大鼠，处死后取右肺上叶肺组织100mg， 用RNA试剂盒提取RNA后，将RNA用逆转录试剂盒逆转录为cDNA。用SybGreen I染料法测实时荧光定量PCR。TRB3上游引物、下游引物分别为：5′-TGATGCTGTCTGGATGACAA -3′，5′-GTGAATGGGGACTT TGGTCT -3′，内参为GAPDH，上游引物、下游引物分别为：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′， 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，逆转录cDNA产物于1%琼脂糖凝胶电泳，测量计算与GAPDH 积分光比值，即为各组肺组织TRB3 mRNA表达量。

1.2.4 各组肺组织湿/干质量比计算 在造模成功并气管滴注干细胞24小时后，每组取3只大鼠，处死后取右肺上叶肺组织，生理盐水小心快速冲洗后，滤纸轻柔擦拭表明残余生理盐水，称量其质量即为肺湿质量(M)。其后将肺组织至于烤箱80℃烘干48 h，此时再次称量其质量即为肺干质量(N)。肺组织湿/干质量比= M/N。

2 结果

2.1三组炎症血清炎性因子水平比较用药24小时后，检测3组股静脉血清IL-6、IL-10、TGFα水平，急性肺损伤模型组血清IL-6水平为(329.47±13.28)ng/L较正常对照组(165.35±15.23)ng/L 显著升高(t=40.335，P<0.01)，干细胞治疗组血清IL-6为(256.67±12.44)ng/L显著低于急性肺损伤模型组(329.47±13.28)ng/L(t=36.322，P<0.01)，说明人脐带间充质干细胞可降低血清IL-6水平，见图1。急性肺损伤模型组血清IL-10水平为(415.44±12.37)ng/L较正常对照组(142.55±13.25)ng/L 显著升高(t=67.325，P<0.01)，干细胞治疗组血清IL-10为(280.76±11.47)ng/L显著低于急性肺损伤模型组(415.44±12.37)ng/L(t=35.704，P<0.01)，说明人脐带间充质干细胞可降低血清IL-10水平，见图2。急性肺损伤模型组血清TGF-α水平为(157.88±10.56)ng/L较正常对照组(27.56±8.33)ng/L 显著升高(t=43.331，P<0.01)，干细胞治疗组血清TGFα为(78.26±9.53)ng/L显著低于急性肺损伤模型组(157.88±10.56)ng/L(t= 25.032，P<0.01)，说明人脐带间充质干细胞可降低血清TGFα水平,见图3。

图1 三组血清IL-6水平比较**P< 0.01

图2 三组血清IL-10水平比较**P< 0.01。

图3 三组血清TGFα水平比较**P< 0.01

2.2三组肺组织TRB3 mRNA表达量比较急性肺损伤模型组肺组织TRB3 mRNA(2.343±0.154)较正常对照组肺组织TRB3 mRNA(0.632±0.013)显著升高(t=49.511,P<0.01)。干细胞治疗组肺组织TRB3 mRNA(1.071±0.065)显著优于急性肺损伤模型组肺组织TRB3 mRNA(2.343±0.154)(t=34.031,P<0.01)。详见图4。

图4 各组TRB3 mRNA表达量比较结果**P< 0.01。

2.3各组肺组织湿/干质量比比较研究结果显示：急性肺损伤模型组肺组织湿/干质量比(6.56±0.21)较正常对照组肺组织湿/干质量比(3.38±0.12)显著升高(t=58.798,P<0.01)。干细胞治疗组肺组织湿/干质量比(3.98±0.28)显著优于急性肺损伤模型组肺组织湿/干质量比(6.56±0.21)(t=32.966,P<0.01)。详见图2由以上数据可知，急性肺损伤后，肺组织肺组织湿/干质量比增加，干细胞治疗后肺组织肺组织湿/干质量比显著降低，详见图5。

图5 各组肺组织肺组织湿/干质量比情况**P< 0.01。

3 讨论

急性肺损伤是呼吸内科常见病、多发病，其是由意外创伤、微生物感染、化学试剂等引起的，以进行性呼吸困难、肺组织急性病变为主要临床表现的肺部疾病[7]。研究表明急性肺损伤时体内多种炎症因子激活，进一步加重肺部损伤[8]。目前关于急性肺损伤尚未发现有效治疗手段，患者往往预后不良[9]。干细胞具有较强的分化潜能，能修复多种组织损伤，急性肺损伤时肺组织内血管内皮、肺泡壁组织、肺泡毛细血管屏障均遭到破坏，体内白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α等炎症因子水平显著升高，促进炎症反应、引起细胞程序性凋亡[10]。研究表明TRB3参与细胞凋亡及炎症反应[11]，且TRB3与急性肺损伤相关研究较少，本研究旨在探究研究人脐带间充质干细胞对急性肺损伤大鼠的血清炎性因子及肺组织TRB3 mRNA表达影响。为人脐带间充质干细胞治疗急性肺损伤研究提供参考依据。

Liu DD等[12]发现脂多糖在诱导急性肺损伤时，起作用的活性成分主要为内毒素。内毒素可引起肺部炎症反应，激活中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞释放白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α等炎症因子，从而损伤肺泡上皮细胞，引起肺组织水肿，进而影响患者通气水平、血氧浓度导致呼吸衰竭[13]。因此可根据血清白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α等炎症因子水平判断急性肺损伤严重程度及预后疗效。

本实验表明在脂多糖诱导急性肺损伤24小时后，疾病组大鼠白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α炎症因子水平显著升高，而人脐带间充质干细胞移植组大鼠血清白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α炎症因子水平较疾病组显著下降，说明人脐带间充质干细胞可缓解急性肺损伤炎症水平。Wei K等[14]发现TRB3可由外部物理化学刺激诱导参与细胞凋亡，但具体涉及分子机制尚不清楚，可能与具体刺激原因及细胞类型有关。研究表明TRB3参与细胞多种生物代谢过程，其中包括细胞凋亡及炎症反应，但目前TRB3与急性肺损伤研究较少[15]。本研究发现在疾病组大鼠肺组织中TRB3 mRNA表达显著高于正常对照组，在进行人脐带间充质干细胞移植后，大鼠肺组织中TRB3 mRNA表达量明显降低。且疾病组肺组织湿/干质量比显著升高，也表明其疾病组大鼠肺组织水肿严重，在进行人脐带间充质干细胞移植后肺组织湿/干质量比明显降低。

综上所述，人脐带间充质干细胞可有效降低急性肺损伤大鼠的血清炎性因子及肺组织TRB3 mRNA表达水平，并减少肺组织湿/干质量比。