参芎化瘀胶囊通过MAPK/ERK对脑缺血/再灌注大鼠的神经保护作用研究*

杨徐一 许仁军 杨黎萍 戴 杰

［1.浙江省台州恩泽医疗中心（集团）路桥医院，浙江 台州 318050；2.浙江省台州市路桥广兴大药房，浙江 台州 318050］

脑卒中是严重威胁中国居民身体健康和生命安全的重大疾病之一，其中约70%脑卒中患者为脑缺血/再灌注（I/R）损伤，死亡率约为10%，致残率高达50%以上［1］。参芎化瘀胶囊是由石菖蒲、川芎、人参、地鳖虫、乳香、五味子、郁金等组成的中药复合方剂，具有化瘀通络等功效，可有效保护缺血/再灌注大鼠神经元，改善大鼠认知功能［2］，但其具体作用机制尚不十分清楚。研究发现细胞凋亡是脑I/R损伤引起神经细胞死亡的重要原因［3］。 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路通过调节转录因子的活性，参与调控细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等多种生物学过程，MAPK/ERK信号通路异常激活可诱导细胞凋亡［4］。因此，本文通过研究参芎化瘀胶囊对脑I/R模型大鼠脑组织MAPK/ERK通路的调节作用，旨在探究其保护脑I/R损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠160只，SPF级，体质量（200±10）g，购自上海市医学实验动物中心，许可证号：SCXK-（沪）20116-0001，批号：1140070009179。本研究涉及所有实验均通过本院动物实验伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器 参芎化瘀胶囊 （由河北联合大学附属医院药剂科提供，冀药制Z20051586）；尼莫地平片（批号：Z15027），购自拜耳医药公司；ERK/MAPK激活剂 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate（TPA，货号：N2060），购自美国APExBIO公司；4%多聚甲醛、DMSO、戊巴比妥钠、TTC染料、HE染色试剂盒，购自上海生工生物技术公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，购自碧云天公司；兔抗MEK1/2多克隆抗体（货号：ab131517）、兔抗 p-MEK1/2多克隆抗体（货号：ab194754）、兔抗ERK1/2多克隆抗体（货号：ab196883）、兔抗 p-ERK1/2多克隆抗体（货号：ab201015）；兔抗 Bcl-2 单克隆抗体（货号：ab32124）、兔抗Bax单克隆抗体（货号：ab32503）、兔抗Caspase3单克隆抗体（货号：ab13847），兔抗GAPDH单克隆抗体（货号：ab181602），羊抗兔 IgG 抗体（货号：ab205718），均购自美国Abcam公司。大鼠电动立体定向注射仪（型号：ALC-H），购自上海奥尔科特生物科技有限公司；荧光显微镜（型号：BX43），购自美国Olympus公司；石蜡烤片机 （型号：HI1220）、切片机 （型号：RM2235），购自德国Leica公司；蛋白电泳仪（型号：PowerPac 基础）、半干转膜仪（型号：1703940），购自美国Bio-Rad公司；Tanon发光成像系统 （型号：5500），购自上海天能公司。

1.3 模型制备 术前给予大鼠2.5%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉。按照改进大脑中动脉线栓法（MACO）构建脑缺血/再灌注（I/R）模型大鼠［5］：将大鼠仰卧固定于手术台，常规消毒。沿大鼠颈部正中偏左处切开皮肤，暴露出颈三角位置，采用钝性分离法迅速分离出左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）。利用血管夹在远心端结扎ECA及其分支，在近心端夹闭CCA和ICA。利用眼科剪在ECA距CCA分叉处约3～5 mm处作一斜向切口，轻轻推入特定脑栓尼龙线（直径0.26 mm），至距CCA分叉处约19 mm处感觉有阻力时停止，将栓线在颈外动脉处扎紧。缝合手术切口并消毒。维持大脑缺血状态2 h后，拉出栓线实现血液再灌注。术中、术后维持大鼠体温均在（37±0.5）℃。假手术组，不植入脑栓尼龙线，其余步骤同模型组。造模成功标准：大鼠清醒后2 h，按照Longa EZ评分标准进行评分［6］。0分：神经功能无任何损伤症状；1分：右前爪不能完全伸直；2分：行走时向右侧不自主倾斜或向右侧转圈；3分：行走时向右侧跌倒或向右侧瘫痪；4分：出现昏迷，不能自主行走；5分，大鼠死亡。将1～3分大鼠纳入本次研究，0、4、5分大鼠排除。另于手术造模后第5日，再次进行神经功能评分。若实验组大鼠数量不足预定数量，则通过随机原则取备用大鼠补足。

1.4 分组与给药 建模成功后，随机分为模型组（含0.05%DMSO的0.9%氯化钠注射液）、SHC组（参芎化瘀胶囊）、尼莫地平组（尼莫地平）和TPA组（参芎化瘀胶囊+TPA），每组30只，另设假手术组（含0.05%DMSO的0.9%氯化钠注射液）30只。参芎化瘀胶囊、尼莫地平片溶于0.9%氯化钠注射液中使用，给药剂量参考动物体表面积剂量换算法［7］，按成人70 kg给药剂量换算：参芎化瘀胶囊48 mg/kg，尼莫地平片15 mg/kg。造模成功后2 h，给予各组大鼠灌胃给药1次，随后每天同一时间按大鼠体质量灌胃相应药物1次，连续5 d。模型组及假手术组同一时间给予等体积含0.05%DMSO的0.9%氯化钠注射液灌胃处理。TPA溶于DMSO，0.9% 氯 化 钠 溶 液 稀 释 至 50 μmol/L（0.05%DMSO）使用，造模成功后2 h，采用立体定向注射仪于大鼠中线外侧1.5 mm、前囟前0.8 mm处进行穿刺，深度3.5 mm，将10 μL TPA轻轻注入脑室内，每天1次，连续5 d。

1.5 标本采集与检测 1）TTC染色法检测大鼠脑组织梗死体积：最后1次给药24 h后，颈部脱臼处死，取缺血脑组织，-20℃，25 min；切为6片，置于 1%TTC溶液中，37℃孵育15 min；移至10%甲醛溶液（pH7.4）中固定。红色部分为无梗死组织，白色部分为发生梗死组织。ImageProPlus软件测量各切片梗死面积，计算脑梗死体积。每组随机取10只大鼠检测。2）HE染色法观察脑组织形态：最后1次给药24 h后，给予各组大鼠2.5%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，经CCA灌注4%多聚甲醛初步固定后，取缺血侧海马组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋，连续切片（4 μm/片），进行脱蜡、水化处理。严格按照 HE 法染色流程对脑组织切片进行染色，中性胶封片，置于光学显微镜下，观察大鼠脑组织形态并拍照。每组随机取10只大鼠制备石蜡切片。3）AnnexinV-FITC/PI法检测神经细胞凋亡情况：最后1次给药24 h后，颈部脱臼处死各组大鼠，取缺血侧海马组织，剪为1 mm3小块，加入胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，计数，取6～10万个细胞，严格按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒说明书逐步进行染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率并分析。每组随机取10只大鼠进行检测。4)Western blotting 法检测 Bcl-2、Bax、Caspase3、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达：研磨粉碎各组大鼠海马组织样品，加入蛋白裂解缓冲液（含protease inhibitor Cocktail），提取脑组织总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白总量，以GAPDH作为内参，检测脑组织Bcl-2、Bax、Caspase3、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2 和 p-ERK1/2蛋白相对表达情况，Tanon软件采集图像并进行灰度分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS 22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较行LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 各组大鼠MACO术后神经功能损伤得分比较（分，±s）

表1 各组大鼠MACO术后神经功能损伤得分比较（分，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与 TPA组比较，&P＜0.05；与尼莫地平组比较，◇P＜0.05。 下同

组 别 n假手术组 1 0模型组 1 0 T P A组 1 0神经功能损伤得分0.2 3±0.0 4 2.6 8±0.5 4*2.5 2±0.4 9*尼莫地平组 1 0 1.4 9±0.2 7#*&S H C 组 1 0 1.5 1±0.3 0#*&

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能损伤得分［6］比较 见表1。与假手术组比较，模型组、TPA组、尼莫地平组、SHC组大鼠神经功能损伤得分显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，SHC组、尼莫地平组大鼠神经功能损伤得分明显降低（P＜0.05），TPA组大鼠神经功能损伤得分无明显变化（P＞0.05）；与TPA组比较，尼莫地平组、SHC组大鼠神经功能损伤得分均明显降低（P＜0.05）；尼莫地平组和SHC组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组大鼠脑组织梗死体积的比较 见图1、表2。与假手术组比较，模型组、TPA组、尼莫地平组、SHC组大鼠脑梗死体积显著增加 （P＜0.05）；与模型组比较，SHC组、尼莫地平组大鼠脑梗死体积明显降低（P＜0.05），TPA组大鼠脑梗死体积无明显变化 （P＞0.05）；与TPA组比较，尼莫地平组、SHC组大鼠脑梗死体积均明显降低（P＜0.05）；尼莫地平组和SHC组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各组大鼠脑组织TTC染色结果

表2 各组大鼠MACO术后脑梗死体积结果比较（±s）

表2 各组大鼠MACO术后脑梗死体积结果比较（±s）

组 别 n假手术组 1 0模型组 1 0 T P A组 1 0脑梗死体积（%）1.0 4±0.0 5 5 2.6 8±9.3 4*4 9.7 8±9.3 1*尼莫地平组 1 0 1 8.2 7±3.2 6#*&S H C 组 1 0 1 9.0 3±3.6 8#*&

2.3 各组大鼠海马组织病理变化比较 见图2。与假手术组比较，模型组大鼠海马组织细胞排列紊乱，神经元细胞萎缩，胞间缝隙增大，出现空泡。与模型组比较，SHC组、尼莫地平组能有效减轻海马组织病理变化。与SHC组比较，TPA组大鼠病理变化相对明显。

2.4 各组大鼠神经细胞凋亡情况的比较 见图3、表3。与假手术组比较，模型组、TPA组、尼莫地平组、SHC组神经细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，SHC组、尼莫地平组大鼠神经细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），TPA组大鼠神经细胞凋亡率无明显变化（P＞0.05）；与TPA组比较，尼莫地平组、SHC组大鼠神经细胞凋亡率均明显降低（P＜0.05）；尼莫地平组和SHC组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组大鼠海马组织病理变化（HE染色，200倍）

图3 各组大鼠神经细胞凋亡的影响

表3 各组大鼠MACO术后神经细胞凋亡结果比较（%，±s）

表3 各组大鼠MACO术后神经细胞凋亡结果比较（%，±s）

组 别 n假手术组 1 0模型组 1 0 T P A组 1 0凋亡率7.3 8±1.8 5 7 2.4 8±1 3.8 7*6 6.7 7±1 3.2 1*尼莫地平组 1 0 3 5.2 4±5.9 5#*&S H C 组 1 0 3 3.3 5±4.8 9#*&

2.5 各组大鼠Caspase3凋亡通路蛋白表达的比较见图4、表4。与假手术组比较，模型组、TPA组、尼莫地平组、SHC组Bax、Caspase3蛋白表达明显上调 （P＜0.05），尼莫地平组、SHC组Bcl-2蛋白表达明显上调（P＜0.05）；与模型组比较，TPA 组、SHC 组、尼莫地平组大鼠Caspase3蛋白表达显著下调 （P＜0.05），SHC组、尼莫地平组大鼠Bax蛋白表达显著下调（P＜0.05），SHC组、尼莫地平组、TPA组Bcl-2显著上调（P＜0.05）；与TPA组比较，尼莫地平组、SHC组Bax、Caspase3蛋白表达明显下调（P＜0.05），Bcl-2 显著上调（P＜0.05），尼莫地平组和SHC组Caspase3蛋白表达比较差异有统计学意义（P＜0.05），其余均无统计学意义（P＞0.05）。

图4 各组大鼠Bax、Caspase3、Bcl-2蛋白的表达

表4 各组大鼠脑组织Bax、Caspase3、Bcl-2蛋白表达的比较（±s）

表4 各组大鼠脑组织Bax、Caspase3、Bcl-2蛋白表达的比较（±s）

组别 n假手术组 1 0模型组 1 0 T P A组 1 0尼莫地平组 1 0 S H C组 1 0 c a s p a s e 3/G A P D H B a x/G A P D H B c l-2/G A P D H 0.8 3±0.1 2 0.6 3±0.1 1 0.2 8±0.1 1 2.8 5±0.4 1* 2.1 7±0.2 6* 0.2 6±0.0 2 2.2 3±0.1 1*# 2.1 9±0.1 8* 0.3 5±0.0 6#1.1 7±0.1 5*#& 1.3 2±0.1 9*#& 0.6 9±0.1 3*#&1.6 3±0.0 5*#&◇ 1.1 5±0.1 2*#& 0.7 8±0.1 2*#&

2.6 各组大鼠MAPK/ERK信号通路蛋白表达比较见图5及表5。各组MEK1/2、ERK1/2蛋白的表达情况比较差异均无统计学意义 （P＞0.05）；与假手术组比较，模型组、TPA组、SHC组p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达明显上调（P＜0.05），尼莫地平组p-ERK1/2蛋白表达明显上调 （P＜0.05），p-ERK1/2蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组、TPA 组比较，SHC组、尼莫地平组p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达显著下调（P＜0.05）；尼莫地平组与SHC组大鼠p-MEK1/2、p-ERK1/2 蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。

3 讨 论

缺血/再灌注损伤指缺血一段时间恢复供血时，发生严重组织损伤及机能障碍，是某些疾病致死的重要原因［8］，其中脑缺血/再灌注损伤是防治重点。近年来我国脑卒中虽致死率有所降低，但仍严重威胁我国居民生命健康［9］。参芎化瘀胶囊由石菖蒲、人参、川芎、地鳖虫、乳香、紫河车、没药、全蝎、龙血竭、五味子、郁金、桑椹子等组成，石菖蒲具有醒神健脑之功效，人参、紫河车可补气血，川芎、乳香、没药可活血行气，桑椹子可养血健脾，郁金、五味子可行气解郁、宁心安神，诸药合用可养血益气，化瘀通络。赵雅宁等发现，参芎化瘀胶囊能通过增加PI3-K/Akt信号活化保护小鼠脑缺血损伤［10］。本研究发现，参芎化瘀胶囊可明显减轻脑缺血/再灌注所致神经功能障碍，降低脑梗死体积，减轻脑组织病理损伤、降低神经细胞凋亡率，提示参芎化瘀胶囊对脑缺血/再灌注所致神经损伤具有保护作用。进一步研究发现，参芎化瘀胶囊对脑缺血/再灌注损伤的保护作用可被MAPK/ERK信号通路激活剂TPA特异性地逆转，提示参芎化瘀胶囊对脑缺血/再灌注损伤的保护作用与MAPK/ERK信号通路有关。

图5 各组大鼠 MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达

表5 各组大鼠 MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的比较（±s）

表5 各组大鼠 MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的比较（±s）

组 别 n假手术组 1 0模型组 1 0 T P A组 1 0尼莫地平组 1 0 S H C组 1 0 p-M E K 1/2/G A P D H E R K 1/2/G A P D H 0.4 3±0.0 7 1.1 9±0.1 7 1.0 9±0.1 2* 1.2 4±0.2 1 0.9 5±0.2 0* 1.2 3±0.1 8 0.4 9±0.1 1#& 1.2 1±0.1 7 0.5 6±0.1 1*#& 1.2 2±0.2 0 M E K 1/2/G A P D H p-E R K 1/2/G A P D H 1.1 3±0.0 9 0.5 3±0.0 8 1.1 2±0.0 8 1.4 9±0.1 1*1.1 6±0.1 5 1.4 5±0.1 2*1.1 5±0.1 4 0.8 7±0.1 1*#&1.1 5±0.1 2 0.8 9±0.1 0*#&

细胞凋亡是缺血/再灌注损伤造成脑组织细胞死亡的主要原因，在脑I/R损伤过程中发挥着重要作用［11］。Bcl-2家族包括B淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2）等抑凋亡成员和Bcl-2相关X蛋白 （Bax）等促凋亡成员［12］。正常情况下，Bax与Bcl-2和Bcl-XL形成二聚体可阻止细胞凋亡发生；受到凋亡刺激时，Bax蛋白表达增加，促使Bax-Bax同二聚体在线粒体膜上形成，促使线粒体膜通透性增加，使得AIF、细胞色素C等凋亡因子进入细胞质中，激活Caspase级联反应而诱发细胞凋亡［13］。楼烨亮等发现，哈巴苷可通过抑制caspase依赖性凋亡通路抑制急性脑缺血所致小鼠海马神经细胞凋亡［14］。本研究发现，与模型组比较，SHC组神经细胞凋亡率明显降低。Western结果显示，模型组Bax、Caspase3蛋白表达明显上调，Bcl-2蛋白表达无明显变化；与模型组比较，SHC组Bax、Caspase3蛋白表达下调、Bcl-2蛋白表达上调。提示参芎化瘀胶囊能抑制Caspase3凋亡通路激活。进一步研究发现，参芎化瘀胶囊对脑缺血/再灌注所致神经细胞凋亡的保护作用可被TPA逆转，提示参芎化瘀胶囊对脑缺血/再灌注损伤所致细胞凋亡的保护作用与MAPK/ERK通路有关。

MAPK/ERK通路是由激酶级联反应介导的信号传导通路，通过一系列级联反应激活靶基因转录，参与细胞增殖、凋亡等生理病理过程［15］。研究表明，MAPK/ERK通路异常激活与心肌缺血再灌注损伤等疾病相关［16］。刘斌等发现，参芎化瘀胶囊可通过上调BDNF表达，促进血管性痴呆大鼠损伤神经元的修复［17］。本研究发现，脑缺血/再灌注损伤后，大鼠脑组织MEK1/2、ERK1/2蛋白总表达无明显变化，但p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达明显上调；参芎化瘀胶囊治疗后，p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达显著下调，对MEK1/2、ERK1/2蛋白总量没有影响，说明参芎化瘀胶囊具备激活MAPK/ERK信号通路的可能。进一步研究发现，参芎化瘀胶囊下调p-MEK1/2、p-ERK1/2表达的作用被TPA逆转，提示参芎化瘀胶囊可能通过抑制MAPK/ERK信号通路发挥神经保护作用。

综上所述，参芎化瘀胶囊可能通过抑制MAPK/ERK信号通路进而抑制Caspase3凋亡通路，发挥对脑缺血/再灌注所致神经损伤的保护作用。