蜡样芽孢杆菌对胆汁淤积大鼠的肝损伤和肠黏膜通透性的影响

李永春，王菊平，李小芹△，郑俊霞

(1.郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院消化科，郑州 450018；2.郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院药学部，郑州 450018；3.许昌职业技术学院医学系，河南许昌 461000)

胆汁淤积型肝损伤是由于肝细胞和(或)毛细胆管排泌障碍引起胆汁流出部分或完全阻滞，引起肝脏损伤。胆汁淤积时进入肠道内的胆汁减少，导致肠上皮细胞间紧密连接表达减少，肠黏膜通透性增加，引起肠道功能紊乱、肠源性感染。肠黏膜受损时，肠道内的细菌和内毒素经门静脉进入肝脏，激活肝内巨噬细胞分泌大量细胞因子，引起炎症级联反应，加重肝损伤，形成恶性循环[1]。益生菌能够调节肠道内菌群生态平衡，改善肠黏膜通透性，有研究显示其可降低胆红素，改善肝损伤[2-3]。本研究旨在探索蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus，Bc)对胆汁淤积大鼠肝损伤和肠黏膜通透性的影响，并分析小肠组织中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达变化，为临床治疗胆汁淤积及相关疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 动物：40只雄性SD大鼠购自河南省实验动物中心，6～8周龄，体质量180～200 g。试剂：Bc活菌胶囊购自安阳市源首生物药业有限责任公司；α-荼基异硫氰酸盐(ANIT)购自美国Sigma 公司；丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清总胆红素(T-BIL)、二胺氧化酶(DAO)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；乳酸(LA)试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司；兔抗Occludin、ZO-1多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1造模方法 将40只雄性SD大鼠，按随机数字表分为对照组、模型组及Bc低、高剂量组，每组10只。除对照组外，其余大鼠均单次灌胃ANIT(50 mg/kg)橄榄油溶液建立大鼠胆汁淤积模型[4]；Bc低、高剂量组于造模次日开始灌胃Bc(1.0×108、2.0×108CFU/kg)，对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，均每天1 次，连续5 d。

1.2.2肝功能和肠黏膜通透性检测 末次给药后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心分离血清，按照试剂盒说明书检测血清中ALT、AST、DAO的活性和T-BIL、LA水平。

1.2.3肝组织病理检测 采血后分离大鼠肝脏，取固定部位经中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色后于显微镜下观察肝组织病理学形态。

1.2.4免疫组织化学检测 采血后取大鼠小肠，常规脱水、包埋，切片，二甲苯脱蜡后乙醇水化，抗原修复后分别滴加Occludin、ZO-1一抗(1∶800)，链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法孵育二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色后复染，显微镜下观察，细胞质染成棕黄色为阳性细胞。用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析Occludin、ZO-1免疫反应阳性的累积光密度值(integrated optical density，IOD)。每张切片随机取3个视野分析，取其平均值。

2 结 果

2.1各组大鼠肝功能检测指标比较 与对照组比较，模型组大鼠血清中AST、ALT和T-BIL水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较，Bc高剂量组大鼠血清ALT、AST及T-BIL水平均明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠肝功能检测指标比较

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与模型组比较

2.2各组大鼠血清LA和DAO水平比较 与对照组比较，模型组大鼠血清LA和DAO水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，Bc低、高剂量组大鼠血清LA和DAO水平均明显降低(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清LA和DAO水平比较

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与模型组比较

A：对照组；B：模型组；C：Bc低剂量组；D：Bc高剂量组

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与模型组比较

2.3各组大鼠肝组织病理结果比较 普通光镜下，对照组大鼠肝小叶结构正常，肝细胞呈整齐的索状排列，细胞形态正常无变性坏死，汇管区未见炎性细胞浸润；模型组肝细胞肿胀、空泡样变形，坏死，细胞排列紊乱，汇管区出现大量的炎性细胞浸润，局部有胆管增生；Bc低、高剂量组肝组织病理损伤明显较模型组为轻，肝细胞排列相对正常，少见炎性浸润，尤其是Bc高剂量组，炎性细胞及肝细胞坏死明显减少，见图1。

2.4各组大鼠小肠组织中Occludin、ZO-1的表达水平比较 与对照组相比，模型组大鼠小肠组织中Occludin、ZO-1蛋白表达明显减少(P<0.05)。与模型组比较，Bc低、高剂量组大鼠小肠组织中Occludin、ZO-1表达均明显增加(P<0.05)，见图2、3。

3 讨 论

自从马歇尔提出了“肝肠轴”的概念，肝脏疾病与肠道之间的相互作用就逐渐受到关注[5]。肝内胆汁淤积时排进肠道内胆汁减少，导致肠黏膜上紧密连接表达减少，肠上皮细胞间紧密连接断裂，肠黏膜屏障受损，通透性增加，肠道内细菌和内毒素移位进入门静脉系统，激活肝内巨噬细胞分泌大量细胞因子，产生炎症级联反应和免疫应答，引起或加重肝损伤。基于肝肠轴的存在，改善肠黏膜通透性、保护肠黏膜屏障可能是治疗肝脏相关疾病的切入点[6]。

肠道内的菌群不仅在人体消化吸收、免疫应答等方面发挥作用，其作为肝肠轴的重要媒介，与肝硬化、肝性脑病、胆汁淤积、脂肪性肝病等有关[7]。有研究证实，益生菌可能通过改善肠道菌群、调节肠道屏障功能等机制进而改善患者肝脏功能的作用[8]。本研究显示Bc可降低胆汁淤积大鼠血清中AST、AST及T-BIL水平，改善肝组织病理，表明Bc具有改善胆汁淤积大鼠肝损伤的作用。

DAO是存在于肠黏膜上层绒毛细胞中具有高度活性的细胞内酶，细胞受损后DAO 进入淋巴管和血液系统，导致血液中DAO 活性增加，DAO是反映小肠黏膜通透性的敏感指标[9-10]。LA是胃肠道固有细菌的代谢产物，哺乳动物不具备将其分解的酶，肠黏膜正常时很少被机体吸收，测定血清中LA水平能够反映肠黏膜的完整程度和通透性的改变[11]。本研究发现模型组大鼠的血清中LA和DAO水平较对照组大鼠明显升高(P<0.05)，说明胆汁淤积大鼠的肠黏膜屏障受到损伤，结构受到破坏，Bc干预后，大鼠血清中LA、DAO水平降低，表明Bc可改善大鼠肠黏膜通透性，对肠黏膜屏障具有保护作用。

肠黏膜上皮细胞与细胞间连接形成完整的生物屏障，细胞间连接以紧密连接最为重要，控制着物质跨膜运输及维持细胞的极性[12]。紧密连接包括Occludin、周膜蛋白紧密连接蛋白家族和Claudin跨膜蛋白家族，Occludin表达于细胞基侧膜顶端，与其他蛋白构成紧密连接的基本结构，调控上皮细胞的跨上皮电阻和膜转运功能[13]。ZO-1则在连接Occludin中起桥梁作用，是Occludin与细胞内骨架系统连接的关键物质，对肠上皮起稳定作用[14]。紧密连接表达的改变可能是胆汁淤积时肠黏膜屏障损伤的重要原因[15]。本实验发现模型组大鼠的小肠组织中Occludin和ZO-1表达水平较对照组大鼠明显减少，Bc干预后，大鼠小肠组织中Occludin和ZO-1表达增加。紧密连接是肠黏膜屏障完整的基础，这提示Bc上调大鼠肠黏膜紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达可能是其改善肠黏膜通透性，进而保护肝损伤的关键因素。

综上所述，Bc可能通过改变肠黏膜通透性、增加紧密连接蛋白表达进而通过肝肠轴对胆汁淤积大鼠肝损伤产生保护作用，然而肝肠之间相互作用复杂，Bc保护肝损伤的具体机制还有待进一步深入研究。