人类肠道微生物研究进展

2018-11-29李蔚然

生物学教学 2018年3期

李蔚然陈珉

(华东师范大学生命科学学院上海 200241)

1 技术背景

人类肠道微生物数量庞大、种类繁多，被称为“第二基因组”[1]，与机体健康有着极为密切的联系。近年来，肠道菌群研究已成为生物学领域的研究热点之一。微生物组研究技术的迅猛发展，使得进一步了解肠道微生物与人类机体的系统发育以及健康的关系成为可能。

肠道菌群的研究主要集中于对肠道中微生物多样性(包括数量、种类和组成)的认识。早期主要采用微生物鉴定和分类的方法，在此基础上进一步了解其功能活性，研究方法如革兰氏染色法、糖发酵试验、IMViC试验等：是通过微生物的分解糖类的能力、是否产酸、产气等理化性质进行物种的鉴定与分类。肠道微生物的研究也正是基于这些技术手段而逐步发展起来的。

微生物普查大约始于25年前。最初使用的方法是16S rRNA基因测序[1]，先利用PCR技术克隆16S rRNA基因，再通过两到三次Sanger法测序(一代测序)完成整个基因的测序。对不同个体进行比较时，只需确定序列的光谱是否相似并判断差异程度。但Sanger法测序的读取长度仅为几百个碱基，每次只能获得部分取样基因的序列，灵敏度低，且成本昂贵，限制了取样深度，对低丰度微生物的分析十分有限。目前已开发出了下一代测序技术，又称二代测序技术或高通量测序技术，一次可对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定。这种方法快速、经济、通量高，每个样品可产生高达数百万的读数，但缺点是读取长度通常非常短[2]。随后又发展出了三代测序技术，这是单分子测序技术，测序时无需经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。二代测序和三代测序技术对宏基因组学研究在广度上和深度上都产生了巨大的影响，带来了研究方法的变革。

宏基因组研究，即对整个群落的DNA进行测序，同时为编目群落中的生物体、基因和基因组提供更广泛、复杂的微生物群落信息。高通量测序技术的出现使得对于一个物种的转录组和基因组进行全面深入的分析成为可能，并允许进行更大规模的宏基因组研究。

人类肠道微生物的第一次群体规模的宏基因组研究由MetaHIT实施，测定了肠道中的1150种常见菌种、330万个基因[2]。人类微生物组计划是迄今最大的人类微生物组研究，在Roche-454平台上靶向16S rRNA基因的V3-V5区域、对健康志愿者样本进行测序，确定无疾病个体微生物多样性，通过16S扩增子测序分析和宏基因组测序确定群落组成和功能，鉴定了超过1000万个基因，将MetaHIT肠基因编目扩展了近180万个，还检测了各个身体部位之间的微生物关联[2]。人类微生物组含有3500至35000个物种水平的运算分类单位(OTU)[3]。胃肠道(包括口腔和粪便)是采样部位中微生物最多样化的，2012年的统计数据中包含了数千个OTU，共计约150个属[4]。

随着研究方法效率和精度的不断提高，研究人员能快速地测得肠道微生物的DNA序列，通过生物信息学对这些数据进行分析以确定肠道微生物的种类和群落组成，并结合非基因组(蛋白质组学和代谢组学)的分析将微生物组的遗传信息和群落结构与个体表型联系起来。比对健康个体与疾病个体的肠道微生物，还能进一步探究微生物对人类健康的影响。近年来，相关研究取得了显著的成果。

2 人类肠道微生物与健康的关系研究进展

2.1 肠道微生物与消化代谢肠道是消化吸收的重要场所，肠道微生物对这一过程起着重要的调节作用。在盲肠和上行结肠中，碳水化合物发酵，微生物快速增长；而在横结肠和下行结肠中氨基酸发酵，微生物增长速度变缓[5]。肠道菌群的基因组中存在许多编码碳水化合物活性酶的基因，包括糖苷水解酶及糖基转移酶等，可帮助宿主消化糖类[5]。

作为机体代谢的重要参与者，肠道微生物不仅能合成多种人体生长发育所必需的维生素(如双歧杆菌、乳酸杆菌可以合成维生素B1、B2、B6和B12，以及维生素K和叶酸等)，还能促进矿物元素的吸收，帮助消化代谢[6]。研究表明，炎症性肠病患者的粪便微生物群与健康受试者不同。例如，厚壁菌门在炎症性肠病和感染性结肠炎患者中明显不足[7]，而这些细菌可能是肠内稳态的关键，其数量的减少与肠黏膜的保护力降低表现出一定的相关性。有研究发现，肠道微生物群落的改变可能与患结肠或直肠癌的风险相关。Ahn等[8]扩增了结肠直肠癌患者和对照受试者粪便细菌的16SrRNA基因，以Roche 454(GS FLX titanium system)超高通量测序技术，用QIIME (quantitative insights into microbial ecology)管道对基因组进行分类，通过定量聚合酶链反应确认分类学差异。结果显示患者整体微生物群落多样性降低，厚壁菌门的相对丰度较低，其中梭菌属的数量消减最为突出。革兰氏阳性梭菌特别是粪球菌属可以有效地将膳食纤维和其他复合碳水化合物发酵为丁酸盐，而丁酸盐可能是具有抑制结肠炎和抑癌作用的主要结肠代谢物。

2.2 肠道微生物与疾病肠道微生物除了具有调节消化代谢的作用，还与糖尿病[9]、肥胖症[10]、肾结石[11]等多种疾病紧密关联。

Qin等[12]基于鸟枪法测序进行了宏基因组范围关联研究(MGWAS)，分析Ⅱ型糖尿病患者的肠道微生物，鉴定了60000种Ⅱ型糖尿病相关标记物，建立了宏基因组连锁群的概念，实现了分类种级分析。结果表明，Ⅱ型糖尿病的特点是中度的肠道菌群生态失调、某些产丁酸菌的减少(如肠道念珠菌和粪肠球菌浓度在患者体内水平较低[9])和各种机会性病原体的增加。

科学家发现肠道微生物的群落结构与肥胖症相关，肥胖症会导致微生物多样性降低[13]。如果肥胖者的肠道菌群恢复到健康状态可以改善与肥胖相关的病症并帮助维持健康的体重[2]。具有相同遗传背景的、喂食低脂肪食物的无菌小鼠中移植了肥胖者肠道菌群的小鼠出现了肥胖症，移植了瘦人肠道菌群的小鼠变瘦[14]；如果把肥胖小鼠的肠道菌群移植给瘦小鼠，原先的瘦小鼠也会出现肥胖[13]，同时携带肥胖者与瘦人菌群的小鼠，体重的增加以及和肥胖相关代谢表型的形成受到了抑制[14]。可见肠道微生物在肥胖症中具有重要作用。

研究发现，草酸杆菌的定植与草酸钙形成结石的风险降低表现出70%的关联度[11]。草酸杆菌可在肠道中代谢草酸盐，缺乏草酸杆菌可能会导致结肠吸收草酸盐增加，造成尿中草酸盐积累，有利于结石的形成[11]。

2.3 肠道微生物与免疫早期B细胞发育可发生在肠固有层，受到共生微生物和肠免疫球蛋白库细胞外信号的调节。实验表明，当无菌小鼠接触了微生物菌群，微生物在体内定植，肠固有层中特异性表达Igλ和Igκ的B细胞的比例将会增加[15]，从而影响B细胞的发育。

表达Foxp3转录因子的CD4+T调节性T细胞(Tregs)对维持免疫内环境的稳定具有关键作用。肠道微生物群的孢子形成组分，特别是梭菌属的IV和XIVa簇可提供富含转化生长因子-β的环境，影响结肠中Foxp3+Tregs的数量及其功能[16]。常规饲养的小鼠早期以口服方式接种梭菌，成年后会表现出对大肠炎和全身性免疫球蛋白E反应的抗性，这有可能成为治疗自身免疫病和过敏反应的新方法。

人在衰老的过程中，肠道微生物的多样性逐渐降低，先前罕见的致病菌株逐渐占据主导地位。Smith等[17]将青年非洲青鳉鱼的粪便喂食给中年青鳉鱼(自身肠道菌群经抗生素处理杀死)，吞食了青年小鱼粪便的鱼与对照组相比寿命显著延长，运动能力也与青年小鱼类似。这一实验结果让我们看到了肠道菌群移植对人类寿命延长潜在的积极效果，但目前的证据十分有限，未来进一步的研究或许能为延年益寿带来更大的可能性。

2.4 肠道微生物与精神状态肠道菌群可影响哺乳动物的大脑发育以及成体行为。与具有正常肠道菌群的小鼠相比，无菌小鼠运动较多、焦虑较少[18]。这种行为表型与有关运动控制和焦虑样行为的第二信使通路和突触长期增强的基因在脑区域的表达改变相关。当无菌小鼠接触了正常的肠道菌群，脚手架蛋白PSD-95(postsynaptic density protein 95)和突触素在纹状体中的表达减少[18]，从而影响控制运动和焦虑行为的神经元电路的信号机制。

肠道菌群还会影响神经系统的发育。胃肠道微生物群落异常的母体免疫激活(MIA)小鼠模型，表现出自闭症谱系障碍[19](属神经发育障碍)。如果用与人类共生的脆弱拟杆菌对MIA小鼠后代进行治疗，可纠正肠道的通透性，改变微生物群落组成，进而改善交际的刻板、焦虑和感觉运动行为的缺陷[19]。

有研究分析了晚期黑色素瘤患者的肠道菌群样本，发现对免疫治疗产生应答的癌症病人肠道中的细菌多样性更高(尤其是产气荚膜梭菌家族的细菌)，而且其体内能特异性杀伤肿瘤的免疫细胞数量也比免疫治疗不响应的患者明显增多。该研究还表明，在进行免疫治疗前通过给予抗生素、益生菌或者移植粪便改变肠道菌群，能增加免疫治疗药物的效果，这些新药目前已用于治疗几种不同类型的癌症，但仍需要进一步的临床试验验证。