卟啉接枝细菌纤维素的制备及其光敏抗菌性能

2018-11-28董建成葛孝栋王清清魏取福

纺织学报 2018年11期

董建成，葛孝栋，王清清，魏取福

(生态纺织教育部重点实验室(江南大学)，江苏无锡 214122)

光动力抗菌化学疗法(PACT)[1]是基于光动力疗法(PDT)，通过光敏剂与细菌结合，在光照下产生活性氧簇(ROS)来灭活细菌。相比于传统抗菌材料，如茶多酚[2]、壳聚糖[3]、重金属银[4]等，PACT法生物毒性低，在灭菌过程中不会使微生物产生耐药性[5]，因而在抗菌材料领域具有广泛的应用前景。

PACT常用的光敏剂有吩噻嗪类、酞菁类、卟啉类光敏剂等。原卟啉(PpIX)是一种卟啉类光敏剂，其前驱体5-氨基酮戊酸(5-ALA)是美国食品药品监督管理局批准药物。游离的PpIX具有高效光敏化能力，但其回收困难，重复利用性差[6-7]。此外，PpIX价格高昂，合成工艺复杂，从而对PpIX进行固定化使其具有可重复利用性变得尤为重要。目前，光敏剂PpIX在多壁碳纳米管[8-9]、多孔硅胶[10]、金属及其氧化物纳米颗粒[11-12]、壳聚糖[13-14]等方面的负载已被广泛研究，但已有文献对PpIX在纤维素基材类的负载，并用于光动力抗菌方面的研究不多。相比于其他材料，纤维素类基材如细菌纤维素、棉等具有天然可降解性、生物相容性和可再生性。

本文利用细菌纤维素(BC)作为PpIX固定载体，首先利用不同浓度的NaIO4氧化细菌纤维素，然后采用还原胺化反应引入乙二胺来键接PpIX，最后评价了负载PpIX后的细菌纤维素对金黄色葡萄球菌的光敏抗菌效果及可重复利用性。

1 实验部分

1.1 实验原料与仪器

细菌纤维素(由木醋杆菌发酵制得)，氢氧化钠、高碘酸钠、乙二胺、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙酸、盐酸羟胺、百里香酚蓝，分析纯，国药集团上海化学试剂公司；氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、N，N′-羰基二咪唑(CDI)、原卟啉，分析纯，上海维塔试剂有限公司；金黄色葡萄球菌(ATCC-6538)，上海协久生物科技有限公司。

LABCONCO型冻干机(美国LABCONCO有限公司)； Nicolet iS 10 型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR，中国赛默飞世尔科技有限公司)；Renishaw RM1000型拉曼光谱仪(英国雷尼绍公司)；Rigaku-D/Max-2500 型X射线衍射仪(XRD，日本理学公司)；TA Q200型热失重仪(TG,美国TA公司)；SUL 510型扫描电子显微镜(SEM，日本日立株式会社)；XQ500 W型氙灯(上海蓝晟电子有限公司)；SW-CJ-ID型单人净化工作台(苏州净化设备有限公司)；GR60DA型高压灭菌锅(南京康辰科学仪器有限公司)； BSP-150型生化培养箱(上海博讯实业有限公司)。

1.2 细菌纤维素的预处理

将发酵培养15 d的细菌纤维素(BC)取出，浸没在质量分数为4%的NaOH溶液中，于80 ℃的水浴锅中碱煮12 h后取出，然后更换NaOH溶液继续碱煮12 h。最后用去离子水反复冲洗、浸泡碱煮后的细菌纤维素，用pH试纸测试其表面酸碱性，直至pH试纸不变蓝。

1.3 氧化细菌纤维素的制备

首先将烧杯中的高碘酸钠(NaIO4)溶液在恒温摇床中加热至37 ℃，然后把直径、厚度相近的细菌纤维素分3组分别放入NaIO4溶液中，对应的NaIO4溶液浓度分别为0.2、0.3、0.4 mol/L。NaIO4溶液与细菌纤维素的用量为V(NaIO4)∶m(BC)=20∶1。将上述反应体系放入到恒温摇床中，于37 ℃反应4 h，然后加入乙二醇(体积为体系体积的1/5)中继续反应4 h。取出反应后的氧化细菌纤维素(BC-CHO)，用去离子水反复冲洗、浸泡，直至用淀粉-KI试纸在BC-CHO表面测试不变黑。最后将BC-CHO放入-40 ℃冰箱预冷冻12 h后，用冻干机在5 Pa条件下干燥12 h得到BC-CHO冷冻干燥膜。

1.4 乙二胺化细菌纤维素的制备

称取3.00 g乙二胺放入烧杯中，加入100 mL DMSO溶解，然后在烧杯中加入乙酸调节体系pH值至6.0，将烧杯放入恒温摇床中，使体系温度上升至37 ℃，然后在体系中加入300 mg所制备的BC-CHO纳米纤维膜，用铝箔包覆烧杯避光，调节摇床速度为100 r/min，反应12 h。取出细菌纤维素膜，用20 mL DMSO清洗3次。

称取3.77 g氰基硼氢化钠放入烧杯中，加入100 mL DMSO溶解，将上述洗涤后的细菌纤维素膜放入烧杯中，然后放入37 ℃恒温摇床(摇床速度为100 r/min)中反应24 h，得到乙二胺化细菌纤维素(BC-EDA)，将BC-EDA取出后先用20 mL DMSO清洗3 次，再用30 mL去离子水清洗3 次。将洗涤后的BC-EDA放入-40 ℃冰箱预冷冻12 h，用冻干机在5 Pa条件下干燥12 h得到BC-EDA冷冻干燥膜。

1.5 原卟啉接枝氨基化细菌纤维素的制备

称取282 mg原卟啉(PpIX)和81 mg N,N′-羰基二咪唑，溶解在75 mL 的DMSO中，然后在40 ℃摇床中活化4 h，摇床速度为120 r/min。在上述体系中加入BC-EDA冻干膜，继续反应24 h，反应结束后先用DMSO清洗(20 mL，3次)，再用去离子水清洗(30 mL，3次)。然后于40 ℃真空干燥5 h，得到原卟啉接枝氨基化细菌纤维素膜(BC-EDA-PpIX)。BC-EDA-PpIX接枝的化学反应流程如图1所示。

图1 细菌纤维素-原卟啉(BC-EDA-PpIX)接枝化学反应流程Fig.1 Chemical reaction process of grafting PpIX on bacterial cellulose via ethylenediamine

1.6 测试与表征

1.6.1醛基含量测定

在250 mL锥形瓶中加入50 mL质量浓度为20 g/L的盐酸羟胺/甲醇溶液和8滴百里香酚蓝指示剂，用氢氧化钠/甲醇标准液滴定至溶液为黄色，不计消耗氢氧化钠溶液的体积[15]。然后向锥形瓶中加入剪碎的BC-CHO样品，40 ℃条件下充分反应3 h后，用0.03 mol/L的氢氧化钠/甲醇溶液滴定至黄色，且在30 s内保持不褪色。醛基含量计算公式为

C=0.03V/m

式中：C为BC-CHO中的醛基含量， mmol/g；V为滴定时消耗的氢氧化钠/甲醇溶液的体积， mL；m为BC-CHO的质量，g。

1.6.2表面形貌观察

采用扫描电子显微镜观察纤维膜的表面形貌和结构。样品在扫描前需经过喷金处理，以便降低其表面放电效应。

1.6.3化学结构测试

采用傅里叶变换红外光谱仪对接枝反应前后的BC膜样品进行测试，利用衰减全反射红外光谱法(ATR-FT-IR)进行分析。分辨率为4 cm-1，扫描次数为16，波数范围为4 000～800 cm-1。

1.6.4拉曼光谱测试

采用拉曼光谱仪对PpIX(粉末)、BC-EDA膜、BC-EDA-PpIX膜进行测试，样品在514 nm激发获得拉曼光谱。

1.6.5热稳定性测试

利用热失重分析仪对材料的热稳定性进行测试。测试范围为20～600 ℃，升温速率为10 ℃/min，在N2保护下进行。

1.6.6晶体结构测试

采用X射线衍射仪对试样的晶体结构进行分析。实验条件为：Cu靶，加速电压40 kV，电流强度200 mA，扫描速度4(°)/min，扫描范围5°～40°。

1.6.7光动力抗菌评价

参照AATCC 100—2012《抗菌纺织品的评价方法》对BC-EDA-PpIX纤维膜光敏抗菌性能进行评价。

将干燥的空白纤维膜和BC-EDA-PpIX纤维膜分别作为空白对照样和实验样。在各样品上剪取若干形状厚度均一的圆形试样，平铺于24孔板内。取0.1 mL浓度为1×108～3×108CFU/mL的菌液接种在各试样上。每个样品均分为2组，分别置于光照及暗室的环境下培养30 min，随后将原菌液及试样上的菌液在离心管中依次等梯度稀释106倍，制作出10倍稀释系列。分别从稀释系列的各离心管中取10 μL溶液注入含琼脂培养基的平皿内，置于37 ℃的恒温培养箱中培养24 h。最后测其菌落数，计算出抑菌率r，对抗菌效果进行评价。

式中：N0、Ni分别为平板上原样生长细菌的数和样品抗菌后所剩余的菌落数。

用质量分数为75%的酒精洗涤上述BC-EDA-PpIX纤维膜2次，干燥后再按上述方法进行抗菌评价；然后继续用酒精洗涤2次，干燥后进行抗菌评价，测试其抗菌持久性。

2 结果与讨论

2.1 BC-CHO纤维膜的结构与性能分析

2.1.1醛基含量分析

通过盐酸羟胺法测定BC-CHO中醛基的含量。当NaIO4浓度分别为0.2、0.3、0.4 mol/L时，测得对应的二醛细菌纤维素醛基含量分别为2.13、3.42、3.76 mmol/g。NaIO4可特异性地氧化纤维素葡萄糖环上2、3号位上的羟基生成二醛细菌纤维素BC-CHO。采用高浓度的NaIO4，在氧化过程中细菌纤维素内部氢键会被严重破坏，细菌纤维素尺寸剧烈收缩，力学性能锐减，影响其应用[16-17]；因此，选择NaIO4浓度为0.3 mol/L所制备的BC-CHO进行后续卟啉接枝反应，其氧化程度适当，纤维膜尺寸变化不大。

2.1.2BC-CHO纤维膜的化学结构分析

图2 不同NaIO4浓度氧化的纤维膜红外光谱图Fig.2 FT-IR spectra of fiber membranes oxidized at different NaIO4 concentrations

2.1.3BC-CHO纤维膜的晶体结构分析

图3为BC及不同氧化程度BC-CHO的XRD谱图。细菌纤维素是高结晶度的I型纤维素，其结晶度可达60%～70%，图中衍射角2θ为14.4°、16.7°、22.6°处为I型纤维素的特征衍射峰[15]。BC经过NaIO4选择性氧化后，BC-CHO部分保留了初始BC的I型纤维素特征峰，同时BC-CHO逐步在2θ为12.6°、20.5°、21.7°处出现衍射峰，并伴随着I型纤维素特征峰的降低，这表明初始BC在被NaIO4氧化过程中发生部分晶型转变(II型纤维素)。由于NaIO4选择性氧化造成了纤维素葡萄糖吡喃环的开环，使得部分链节被破坏，使得原有的结晶规整度降低，从而在XRD谱图中显示了较多位于主要衍射峰之间的杂散峰，其中18°～20°处的是非晶纤维素的衍射峰[[21]。

图3 不同NaIO4浓度氧化的纤维膜X射线衍射谱图Fig.3 XRD spectra of fiber membranes oxidized by NaIO4at different concentrations

2.1.4BC-CHO纤维膜的热稳定性分析

图4示出BC、BC-CHO纤维膜的TG和DTG曲线。BC的化学改性会显著改变纤维膜的热分解行为，如热分解温度降低、残炭率提高等[22]。从图4可看出，氧化后的细菌纤维素膜热分解行为发生了明显的变化。在N2氛围中，BC在280 ℃开始分解，在300～340 ℃时质量损失速率增大，纤维素在分解时，先得到左旋葡萄糖，然后进一步分解为CO、CO2等小分子[23]。BC-CHO分3步降解：第1步，100 ℃左右时的质量损失为葡萄糖吡喃环上醛基形成的水合醛和半缩醛受热脱水造成的；第2步在220～250 ℃脱水；第3步在280～300 ℃降解。所有BC-CHO的热分解温度都低于BC，且随氧化程度的提高逐渐降低。

图4 不同NaIO4浓度氧化的纤维膜热稳定性曲线Fig.4 TG(a) and DTG (b) curves of fiber membranes oxidized by different concentrations NaIO4

2.2 BC-EDA纤维膜的化学结构分析

图5为BC、BC-CHO、BC-EDA纤维膜的红外光谱图。可以看出：接枝乙二胺后的氧化细菌纤维素在1 730、880 cm-1处的醛基特征峰消失；在1 560 cm-1处出现新的吸收峰，为BC-EDA上N—H的弯曲振动峰[24]。醛基特征峰的完全消失和新吸收峰的出现，表明BC-CHO上的醛基完全被乙二胺取代。

图5 纳米纤维膜的红外光谱图Fig.5 FT-IR spectra of naofibrous membranes

2.3 BC-EDA-PpIX纤维膜的性能分析

2.3.1PpIX接枝前后细菌纤维素膜的形貌结构

图6示出初始细菌纤维素BC和原卟啉接枝后BC-EDA-PpIX的表面形貌。可以看出，BC在进行化学改性前，表面纤维集束包覆成连续相，形成对内层纤维的遮掩。经过氧化、PpIX接枝后，BC表面集束的连续相消失，显露出内层纤维，BC-EDA-PpIX内层纤维的高比面积更有利于卟啉与底物的接触，从而有效发挥负载卟啉的光敏化能力。

图6 BC和BC-EDA-PpIX纤维膜的扫描电镜照片Fig.6 SEM images of BC and BC-EDA-PpIX fibrous membranes

2.3.2BC-EDA-PpIX的拉曼光谱

图7为PpIX、BC-EDA、BC-EDA-PpIX的拉曼光谱图。由于PpIX具有对称结构，所以采用拉曼光谱仪来表征PpIX固定化后的化学结构。

图7 PpIX粉末、BC-EDA-PpIX纤维膜、BC-EDA纤维膜的拉曼光谱图Fig.7 Raman spectra of pure PpIX powder, BC-EDA-PpIX and BC-EDA fibrous membrane

2.3.3BC-EDA-PpIX纤维膜的抗菌性能

表1 BC-EDA-PpIX纤维膜对金黄色葡萄球菌的杀菌效果Tab.1 Antibacterial effect of BC-EDA-PpIX fibrous membrane against Staphylococcus aureus

BC-EDA-PpIX经过酒精洗涤后光敏抗菌效果虽有所降低，但经过5次洗涤后抑菌率仍达到56.61%。细菌纤维素的直径在纳米级别，纳米尺寸的结构容易受到外界因素的影响，而PpIX共价结合在细菌纤维素膜表面，洗涤过程中可能会使部分光敏剂脱落，造成抗菌效果下降。在今后的研究工作中将会采用大直径纤维素制品如棉织物、麻织物等作为光敏剂载体进行共价负载，制备光敏抗菌织物，以实现长效的光敏抗菌效果。