梅花鹿源不动杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

李 娟周 浪王 研曾邦权段博芳李维芬段 纲常 华李国雄 代飞燕*

(1.云南农业大学动物医学院，昆明，650201；2.云南省昆明市濒危动植物收容拯救中心，昆明，651700；3.云南省动物疫病预防控制中心，昆明，650201；4.云南林业职业技术学院，昆明，650224)

不动杆菌(Acinetobacterspp.)广泛分布于自然界，在水、土壤、乳和健康动物皮肤、胃肠道、生殖道和呼吸道中都可存在，通常无致病性。近年来，从河蟹中分离不动杆菌[1]，死亡大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)[2]，异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)[3]，马属(Equus)动物[4]，犬[5]，牛羊等反刍动物[6-8]，禽类[9-10]，草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[11]，流产胎猪[12]，86例患重症监护室(Intensive Care Unit，ICU)患者[13-15]等均较多研究和报道。由于现在养殖的集约化，条件气候改变等各种应激，病毒性疾病的侵袭造成的免疫力下降，饲养条件简陋，养殖密度过大等均为不动杆菌病的迅速传播创造了有利条件。

梅花鹿(Cervusnippon)是一种中型鹿，属于真兽亚纲(Eutheria)、偶蹄目(Artiodactyla)、鹿属，是中国国家Ⅰ级保护动物，列入世界自然保护联盟(International Union for Conservation of Nature，IUCN)2015年《濒危物种红色名录》ver 3.1——低危(LC)(https：//www.iucn.org/)。梅花鹿在野外的活动量非常大，免疫力较强，但是经过驯化饲养的梅花鹿由于饲养条件较好，运动量减少等因素致使其机体素质下降，更加容易造成细菌感染致病。一旦细菌感染，轻则影响动物生产，使得饲料回报率降低，重则造成大规模动物死亡，给养殖户带来重大经济损失。另外，在人工饲养方式下，抗生素的滥用也该引起重视。如果长期使用一种或几种抗菌药物来治疗则容易造成细菌产生耐药性，因此养殖场对细菌病进行治疗时，需要先做药敏试验筛选出敏感药物。根据抗生素使用原则，选择几种敏感的药物，通过变换药物或联合使用来防止耐药性的产生[16-17]。因此通过本实验研究可准确诊断病原菌，筛选敏感药物进行有效治疗。

1 材料与方法

1.1 材料

云南保山某养殖场，自从2012年开始养殖梅花鹿，养殖规模约为350～500头，饲养目的主要做药用，外来引种扩繁，采用“自繁自养，全进全出”的饲养模式。无菌采集病死梅花鹿的有出血和实质病变的心脏、肝脏、肺脏于无菌平皿中进行细菌分离。普通琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、血琼脂培养基、普通肉汤均由云南农业大学动物医学院的公共平台实验室配制提供，并经检验合格。药敏纸片、生化鉴定管都是在杭州天和微生物试剂有限公司购买。SPF小鼠，雌雄各一半，6周龄，体重20～25 g，在昆明医学院SPF实验动物中心购买。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离培养与鉴定

解剖后取出梅花鹿的心脏、肝脏、肺脏，用划线接种法接种于普通肉汤琼脂培养基上，置于37℃ 恒温培养箱中，培养12～24 h，进行革兰氏染色、镜检，观察细菌形态。根据菌落形态及显微镜观察结果再挑取单个典型菌落划线接种于普通琼脂平板37℃进行纯化培养[5]。经分离得到的纯培养物用划线接种法分别接种于伊红美蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基和10%绵羊血脱纤维琼脂培养基(由云南农业大学动物医学院配制并检验合格)上置于37℃恒温培养箱中，培养16～24 h，观察菌落形态及在各种培养基上的生长情况。

1.2.2 生化鉴定

用接种环挑选纯化培养后的优势菌落接种于生化鉴定管中，接种完后，置于37℃恒温培养箱中，培养24～48 h，进行观察，记录结果。

1.2.3 分子生物学鉴定

分离纯化细菌后，抽提基因组DNA利用细菌16S rDNA通用引物扩增16S rDNA基因片段。以新鲜培养的菌液为模板，采用细菌16S rDNA通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，对菌株的16S rDNA进行PCR扩增。PCR反应体系25 μL，预混DNA聚合酶12.5 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。取PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，根据通用型DNA纯化回收试剂盒说明书回收目的条带。将胶回收产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果提交到NCBI的BLAST检索系统进行序列比对，找到同源性最高的几个序列，确定分离细菌属，寻找同源性最高的细菌，下载该属的序列，用Mega 6.0构建系统进化树。并采用邻接法(Neighbor Joining method)构建系统发育树。参考菌株信息见表1。

表1 参考菌株信息

Tab.1 Reference strain information

1.2.4 动物试验

用培养的菌液进行试验动物腹腔注射，菌液浓度为2.5×108cfu/mL，具体方法为每株菌注射5只小白鼠，剂量为0.5 mL，对照组注射生理盐水0.5 mL。

1.2.5 试验动物解剖及细菌分离

试验动物攻毒后观察老鼠精神状态和死亡情况，待老鼠死亡后，在紫外灯照射过的无菌解剖台上，打开小鼠腹腔、胸腔，观察各个脏器的病理变化，无菌采集小鼠心脏和肝脏进行细菌分离培养。

1.2.6 致病菌的鉴定

将死亡试验动物肝脏中分离出来的细菌进行革兰氏染色镜检，对比原始病料中分离的细菌，最终确定是否是主要致病菌。

1.2.7 药敏试验

用高压灭菌后的三角棒将培养后的菌液均匀涂布于普通琼脂平板上，贴上药敏纸片，轻轻按压，确保贴稳，防止掉落和移动，使得药敏纸片完全与培养基接触，以免影响药物扩散不均匀。

2 结果与分析

2.1 病原菌的鉴定

从病料心脏、肝脏、肺脏分离的细菌在普通琼脂平板上置于37℃恒温箱中培养18～24 h，生长菌落形态都为边缘整齐，光滑，湿润，乳白色，圆形菌落。将菌株划线接种于伊红美蓝琼脂固体培养基、麦康凯琼脂固体培养基和绵羊鲜血固体琼脂培养基上，培养条件同上，结果该株菌在麦康凯培养基上都长出典型红色菌落(图1)，在伊红美蓝培养基上都长出紫黑色带金属光泽菌落(图2)，在绵羊血琼脂培养基上生长良好，未出现溶血现象(图3)。挑取典型菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜油镜观察，结果该株菌均为革兰氏阴性菌，形态都为长杆状或短杆状菌落，多数散在(图4)。

图1 麦康凯培养基Fig.1 McGonagall medium

图2 伊红美蓝培养基Fig.2 Eosin-Methy blue agar medium

图3 血琼脂平板Fig.3 Blood agar plate

图4 100×目镜Fig.4 100×eyepiece

2.2 生化鉴定

挑取纯培养物的单个菌落于普通肉汤中，37℃条件下2000 r/min振荡培养18 h。分别接种于微量生化鉴定管中，37 ℃恒温箱中水平静置培养24～48 h，观察结果并记录(表2)。根据文献[7-13]可初步鉴定为不动杆菌。

表2 生化鉴定结果

Tab.2 The results of biochemical identification

续表2

2.3 16S rDNA序列分析结果

16S rDNA 测序，将获得的16S rDNA 基因序列与 GenBank中登录细菌16S rDNA进行比对，表明该分离菌16S rDNA 基因序列与已发表不动杆菌的16S rDNA 基因同源性较高，达97 %以上，由图5可知，目的基因片段大小为1500 bp，与理论值一致。证明该菌属为不动杆菌，与生化试验鉴定结果一致。将该分离株与参考菌株16S rDNA 序列进行比对分析，显示该株为不动杆菌与新加坡分离株属于同一分支，与中国和印度分离株亲缘关系较近，而与美国分离株亲缘关系较远(图6)。

图5 16S rDNA的PCR扩增结果Fig.5 PCR amplification of 16S rDNA

图6 MHLBDYN201710菌株系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of MHLBDYN201710 strain

图7 MHLBDYN201710菌株亲缘关系比对Fig.7 Phylogenetic relationship of MHLBDYN201710 strain

2.4 致病性实验结果

将该株细菌的扩大培养物对实验组的昆明小鼠进行腹腔注射，用菌液分别注射5只小鼠，注射量都为0.5 mL，而对照组的实验小鼠分别进行腹腔注射无菌生理盐水0.5 mL。结果显示，实验组小鼠死亡时间为24～48 h，48 h之后没有死亡小鼠均存活下来；对照组小鼠全部存活。

2.5 实验小鼠病理剖检结果

将死亡后的实验小鼠按常规方法进行病理剖解，发现小鼠肝脏、心脏、肠黏膜及其他内脏器官严重出血，肠壁变薄、泛黄、鼓气，输卵管出血等病变。

2.6 目的菌株回收

死亡小鼠解剖后，取出小鼠肝脏，并进行细菌分离。在37℃恒温箱中培养分离出的细菌，选择单个菌落并进行革兰氏染色。菌落形态与原始分离菌一致，为圆形光滑、灰白色、边缘整齐的菌落；再经革兰氏染色、镜检也发现与原分离菌的形态相同，它们都是长杆菌或短杆状菌落，大部分呈分散状，不易褪色。表明其为该病的主要病原菌。

2.7 药敏试验结果

该病例主要致病菌是不动杆菌，菌株对氧氟沙星、卡那霉素、恩诺沙星、阿米卡星、大观霉素、头孢舒巴坦、左氧氟沙星、阿莫西林、庆大霉素、青霉素、头孢拉定、阿奇霉素等大多数抗菌药物均高度敏感(表2)。 药敏试验操作方法按2005年版CLSI/NCCLSM100-S15所述方法进行。

表3 药敏试验结果

Tab.3 The results of drug sensitive test

续表3

注：抑菌圈的直径≥20 mm为极敏感，15～20 mm为高度敏感，10～14 mm为中度敏感，10 mm以下且>0为低度敏感，等于0则为不敏感

Note：Diaphragm diameter≥20 mm extremely sensitive，15-20 mm highly sensitive，10-14 mm moderately sensitive，diaphragm diameter<10 mm，diaphragm diameter>0，low sensitivity，=0 not sensitive

3 讨论

通过以上实验结果可以得出该梅花鹿养殖场本次发病的病原菌主要是不动杆菌，在实验中从病死鹿的肝脏都分离得到了不动杆菌，生化鉴定结果也与《伯杰氏细菌鉴定手册》一致[18]。从药敏实验可以看出，由于该场为原生态放养，可以看出分离得到的菌株耐药性并不强。大部分的抗生素对于该菌的抑菌作用较为理想，对于本病的治疗应该选择对菌株均比较敏感的抗生素，如头孢唑林、氨苄西林、强力霉素进行治疗方能达到较好的治疗效果。另外，在使用抗生素的同时，还需要联合使用加强免疫的辅助药物，如加入多维进行饮水。

流行病学调查发现，该场在饲养动物时添加精料过多。由于大量的精料充满胃内发酵产酸，大量的酸性食物进入肠道，造成胃肠道pH下降，致使肠道菌群失调。为了更好地预防类似细菌病的暴发，建议养殖场降低养殖密度，提高养殖环境条件；适当添加粗料，保证粗纤维的足量摄入。

也曾有文献报道大熊猫感染不动杆菌后表现为呼吸道症状，随后急性死亡[2]。可见随着野生动物养殖业的发展，细菌性疾病的发生在各种人工养殖的野生动物身上也越来越常见。饲养者应给与足够重视。