红景天苷减轻手机电磁辐射对大鼠睾丸支持细胞损伤的实验研究

浙江中医药大学附属宁波市中医院 宁波 315012

近年来，随着手机应用的日益广泛，手机辐射对人体健康的危害日益受到人们的关注。睾丸是对电磁辐射最敏感的靶器官之一，研究显示手机频率的电磁辐射能够导致小鼠睾丸支持细胞受损，使精子发生的微环境发生改变，从而影响正常精子的发生、发育[1]。红景天苷（salidroside）是我国传统药用植物红景天的主要有效成分,除存在于红景天中外，还存在于杨柳科植物毛柳的树皮、木樨科植物女贞子（Ligustrum lucidum Ait）的果实中，具有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基等作用[2]。近年来，研究发现红景天具有良好的抗辐射效果[3]，但有关红景天对睾丸组织辐射损伤是否具有保护作用还鲜有报道。因此，本研究原代培养大鼠睾丸支持细胞，模仿手机通话时的发射频率和平均功率密度，同时以红景天苷干预，探讨手机辐射对睾丸支持细胞的损伤以及红景天苷对睾丸支持细胞的保护作用，为深入研究红景天苷在雄性生殖系统疾病中的临床应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂 荧光定量PCR仪Mx3000P型（美国Stratagene公司），普通PCR仪（德国Roche公司）,倒置显微镜（日本Olympus公司），CO2培养箱（德国Heraceu 公司），全球通系统数字手机（900 MHz），电磁辐射测定仪（标智GM3120）。DMEM/F12培养基、胰蛋白酶和胎牛血清均购自美国Hyclone公司（批号：0781003、SH30848.01B、SV30087.03）；Ⅱ型胶原酶（批号：C5100L0041）购自上海李记生物科技有限公司；Real-time PCR Master Mix购自TaKaRa公司（批号：BK1101）；FasL抗体和HRP标记的羊抗兔IgG抗体购自北京百奥莱博科技有限公司（批号：K15463、BL0817）；CCK-8购自上海碧云天生物技术公司（批号：CZ677）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，GPx）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所（批号：20161021、20160916、20160925、20161023）；红景天苷（纯度≥97.5%）购于上海晶纯生化科技股份有限公司（批号：MG0020）。

1.2 睾丸支持细胞原代培养及鉴定 睾丸支持细胞分离和培养方法参考文献[4]，睾丸支持细胞通过速差贴壁法进行纯化,采用特异FasL抗体免疫组化进行鉴定，细胞纯度=（FasL阳性细胞数/细胞总数）×100%，纯度达到90%后备用。将对数生长期的细胞消化后制备成5×104/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔体积0.2mL；另外制备2×104/mL的细胞悬液接种于24孔板，每孔体积0.5mL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，用于后续试验。

1.3 实验分组及处理 将细胞分成5组，对照组、辐射组、辐射+低剂量红景天苷组、辐射+中剂量红景天苷组和辐射+高剂量红景天苷组，每组5孔。对照组不作任何处理，其余各组细胞上方15cm处均放置频率为900MHz、平均功率密度为370μW·cm-3的辐射源，接受24h/d，连续5d的辐射,期间更换充电装置，暴露参数采用标智GM3120电磁辐射测定仪测定。同时根据预实验结果，将配制好的红景天苷分别加入辐射组+低剂量红景天苷组、辐射组+中剂量红景天苷组和辐射组+高剂量红景天苷组中，使各组培养液中红景天苷浓度分别为 100、200和 400μg·mL-1，各组细胞继续培养5d后备用。

1.4 检测指标

1.4.1 CCK-8法测定细胞增殖活性 选对数生长期的细胞接种于96孔板内，各组细胞按上述方法培养后加入CCK-8 10μL，培养60min后酶标仪450nm测定各组吸光度值。

1.4.2 紫外分光光度法检测细胞培养液SOD、CAT、GPx的活性和MDA的含量 细胞分组处理同前，收集24孔板内各组细胞培养上清液，用紫外分光光度计分别测定SOD、CAT、GPx活性及MDA含量，实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.3 FQ-PCR检测细胞雄激素结合蛋白（androgen binding protein，ABP）和抑制素 βB 亚基（inhibinβB，INHβB）mRNA表达 收集处理后的各组细胞，提取总RNA。总RNA提取与cDNA合成按照试剂盒说明书操作，cDNA产物置于-20℃保存。各基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。反应体系参照说明书，反应条件：95℃预变性10min，95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s，共 40 个循环，计算各组细胞中ABP和INHβB基因相对表达量，计算公式为 2-ΔΔCT。ΔCT1=对照组目的基因 CT 值-对照组内参基因CT值，ΔCT2=实验组目的基因CT值-实验组内参基因 CT值，ΔΔCT=ΔCT2-ΔCT1。

1.5 统计学分析 采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间均数比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 结果

2.1 大鼠睾丸支持细胞分离鉴定 原代睾丸支持细胞呈不规则形，细胞质中高表达FasL，免疫组化染色可见细胞质内大量棕黑色颗粒，证实为睾丸支持细胞，经鉴定纯度＞95%。见图1。

图1 大鼠睾丸支持细胞FasL表达（200×）Fig.1 Expression of FasL in sertoli cells(200×)

2.2 各组大鼠睾丸支持细胞增殖活性比较 与对照组比较，辐射组大鼠睾丸支持细胞增殖活性明显减弱（P＜0.01）。与辐射组比较，辐射+中、高剂量红景天苷组细胞增殖活性增强（P＜0.01），增殖活性随红景天苷剂量增加而增加（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠睾丸支持细胞增殖活性比较Tab.2 Comparison of sertoli cell proliferation activity in each group

2.3 各组细胞氧化应激指标比较 与对照组比较，辐射组SOD、CAT和GPx活性均明显降低，MDA含量明显增高（均P＜0.01）。与辐射组比较，辐射+中剂量红景天苷组和辐射+高剂量红景天苷组SOD、CAT和GPX活性均有不同程度升高，MDA含量则显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。中、高剂量红景天苷组细胞中SOD、CAT和GPx活性随红景天苷剂量增加而增加，MDA含量则随红景天苷剂量增加而降低（均P＜0.01）。见表 3。

表3 各组细胞氧化应激指标比较Tab.3 Comparison of cell oxidative stress indexes in each group

2.4 各组细胞ABP和INHβB mRNA表达比较与对照组比较，辐射组ABP和INHβB mRNA表达量明显减少（均P＜0.01）。与辐射组比较，辐射+中剂量红景天苷组和辐射+高剂量红景天苷组ABP和INHβB mRNA相对表达量明显增高（P＜0.05或P＜0.01）。中、高剂量红景天苷组睾丸支持细胞ABP和INHβB mRNA相对表达量随红景天苷浓度增加而增加（均 P＜0.01）。见表 4。

表4 各组细胞ABP和INHβB基因mRNA相对表达量比较Tab.4 The mRNA relative expression of ABP and INHβB in each group

3 讨论

当前，电磁技术的广泛应用为人类的学习、生活和工作带来诸多便利，同时也造成了环境的电磁污染，威胁人类的健康。生殖系统是对电磁辐射敏感的靶器官，持续电磁辐射可导致精液质量下降、睾丸氧化损伤，曲细精管的生精上皮变薄，支持细胞和间质细胞不同程度变性，最终可导致不育症[5-6]。睾丸支持细胞在生精小管内为精子的发生发育提供保护和多种必要物质。INH是卵泡刺激素与其受体结合后，睾丸支持细胞特异性分泌的一种糖蛋白激素，对下丘脑-垂体-性腺轴中卵泡刺激素的产生起负反馈调节作用。INH有两种形式：INH A（αβA）和INH B（αβB），男性体内主要为INH B。研究表明，INH B与精子发生有密切关系，其血清浓度降低常预示存在生精功能障碍，是目前已知的评价男性精子发生最好的内分泌标志物[7]。ABP是由睾丸支持细胞分泌的一种载体蛋白，对雄激素有高度亲和力,ABP的存在使曲细精管管腔内的雄激素水平维持稳定，为精子的分化和成熟提供保障。ABP分泌异常可导致曲细精管管腔内的雄激素水平异常，影响精子的分化和成熟[8]。本研究显示，手机电磁辐射可引起睾丸支持细胞分泌ABP和INH βB降低，这可能是手机电磁辐射导致男性精液质量下降的原因之一。另外，多项研究表明手机电磁辐射能造成氧化损伤，影响精子质量[5-9]，而本研究也发现手机电磁辐射亦能使大鼠睾丸支持细胞培养液中MDA含量升高，抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性降低，提示手机电磁辐射能影响睾丸支持细胞抗氧化酶类活性，并造成睾丸支持细胞脂质损伤，与既往研究报道一致。

红景天属为多年生草本或亚灌木植物，我国有73种，其中大花红景天产于海拔2 800～5 600m的高寒、缺氧、强紫外线照射的西藏地区，因红景天苷含量丰富稳定被中国药典收录。红景天具有益气活血、通脉平喘的功效，用于气虚血瘀、胸痹心痛、中风偏瘫、倦怠气喘。红景天能改善机体的适应性，能提高机体对抗各种化学、生物或物理因素刺激的能力，使紊乱的机能得到恢复，即“适应原样”作用[10-11]。红景天苷是红景天的主要有效成分，现代药理研究表明红景天苷还具有抗缺氧、抗癌、抗抑郁、抗焦虑、抗炎以及抗氧化等多种功能[2]。近来研究表明红景天苷具有良好的抗辐射功效，能有效对抗紫外线、X射线及60Coγ射线对机体造成的损害[3,12]。本研究结果显示，红景天苷可抑制手机电磁辐射对睾丸支持细胞分泌功能的损害，说明红景天苷能对抗手机辐射对睾丸支持细胞造成的损伤，进而有助于精子的发生和发育。另外研究表明红景天苷具有较强的抗氧化作用，能有效清除机体运动后产生的自由基[13]，而本研究中红景天苷能有效提高睾丸支持细胞SOD、CAT和GPx活性，对抗手机辐射引起的抗氧化酶活性降低，从而减轻氧化应激造成的睾丸支持细胞损伤，提示红景天苷在睾丸组织同样具有抗氧化功效。

雄性生殖系统对辐射损伤极为敏感，而红景天具有“适应原样”作用，抗辐射功效明显，因此红景天在治疗雄性生殖系统辐射损伤方面具有较高的潜在应用价值。本研究发现其对手机电磁辐射造成的睾丸支持细胞氧化受损具有保护作用，并对睾丸支持细胞蛋白分泌功能的恢复具有促进作用，为红景天在传统中医男科治疗电磁辐射损伤方面的应用提供了一定的实验基础。但辐射损伤对睾丸功能的损害是多方面的，如精子的营养、免疫因子的分泌、血睾屏障的构建等，因此红景天苷在雄性生殖系统辐射损伤中的作用有待进一步深入研究。