刺梨不同提取成分对B16细胞增殖及酪氨酸酶活性的影响

浙江中医药大学药学院 杭州 310053

近年来，随着环境污染的日益严重，大气臭氧层遭到破坏，紫外线照射日益强烈。紫外线可以促使人体皮肤中黑色素细胞合成黑色素，导致皮肤色素沉积失常，影响面容外观，给人们带来一定的心理和精神压力，影响生活质量[1]。酪氨酸酶是一种含铜的氧化还原酶，可以催化黑色素细胞中的酪氨酸生成黑色素，是黑色素合成过程的主要限速酶，其表达水平和活性决定着黑色素合成的速度和产量[2]。研究表明，抑制酪氨酸酶活性可以减少皮肤黑色素的生成，并具有良好的美白功效[3]。近年来随着绿色自然理念的日益普及，植物成分的化妆品因取材天然、安全性高、符合消费者对健康的追求等特点，在化妆品领域异军突起，众多的研究者开始尝试从植物提取物中筛选抑制酪氨酸酶活性的天然成分。

刺梨（Rosa roxburghii）为蔷薇科蔷薇属植物缫丝花的果实，又名茨梨、木梨子、文光果、送春归，为云贵高原特有的野生植物，有消食健脾、收敛止泻的功效[4]。刺梨中含有丰富的维生素、多酚、黄酮、有机酸、多糖、氨基酸以及微量元素等物质，具有很高的营养价值[5-6]。研究发现，刺梨中多种活性成分，如刺梨多酚、刺梨黄酮、刺梨多糖等均具有抗衰老、抗氧化以及清除自由基的作用，在美白化妆品开发领域具有潜在的应用前景[7-8]。郑殿钦[9]以刺梨为原料，开发了刺梨美白茶，发现其具有抗氧化、美白、健胃消食等作用。目前对于刺梨多糖、黄酮及多酚的提取技术和效率，以及其具体作用机制尚没有系统研究，限制了刺梨作为美白添加剂的应用。本实验以刺梨为原料，制备了刺梨多糖、黄酮及多酚提取物，并研究其对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖及细胞内酪氨酸酶活性的影响，以期为刺梨在美白化妆品中的应用提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验药材 刺梨采自贵州黔南，经浙江中医药大学药学院中药资源研究所陈孔荣副教授鉴定为蔷薇科蔷薇属植物缫丝花（Rosa roxburghii Tratt.）的果实。

1.2 细胞和主要试剂 小鼠黑色素瘤B16细胞购于苏州北纳创联生物技术有限公司（批号：BNCC 100653）。RPMI-1640培养基、胰酶、PBS均购于南京凯基生物科技发展有限公司（批号：20170213、20170310、20170321）；胎牛血清购于浙江天杭生物科技股份有限公司（批号：20161207）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、乙醇购于国药集团化学试剂有限公司（批号：20170113、20170317）；四甲基偶氮唑蓝购于杭州昊天生物技术有限公司（批号：3068B512）；左旋多巴（levodopa，L-DOPA）购于上海源叶生物科技有限公司（批号：O25M8K32143）；Triton X-100、维生素C购于Sigma公司（批号：WXBC3534V、WXBB4747V）；大孔吸附树脂HPD-600、AB-8购于沧州宝恩吸附材料科技有限公司（批号：20170421、20170422）。

1.3 主要仪器设备 BLX-800酶标仪为美国Bio-Tek公司产品；二氧化碳培养箱、生物安全柜为美国Thermo公司产品；倒置显微镜为日本Nikon公司产品；UV-1800型紫外可见分光光度计购于日本岛津公司。

1.4 实验方法

1.4.1 刺梨不同提取成分的制备及纯度检测

1.4.1.1 刺梨多糖 采用水提法提取刺梨多糖[10]。将干燥的刺梨果实粉碎，过50目筛，取适量粉末，放入圆底烧瓶中，加入50倍量的蒸馏水，在80℃下提取3次，每次1h。过滤得到多糖溶液，再经过旋转蒸发仪蒸干水分，得到多糖粉末，采用苯酚-硫酸法测定刺梨多糖纯度[11]。

1.4.1.2 刺梨黄酮 采用醇提法提取刺梨黄酮[12]。将干燥的刺梨果实粉碎，过50目筛，取适量粉末，加入15倍量的80%乙醇，在90℃下提取3次，时间分别为80、40、40min。过滤得到黄酮溶液，再经过旋转蒸发仪蒸干乙醇，浓缩液蒸干后得到粗黄酮浸膏，用HPD-600大孔吸附树脂装柱上样，吸附1h，10倍柱体积的蒸馏水以4mL·min-1的流速洗去糖类等杂质，10倍柱体积40%的乙醇以3mL·min-1的流速洗脱，得到洗脱液，再经过旋转蒸发仪蒸干水分，真空干燥得到刺梨黄酮粉末，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定刺梨黄酮纯度[13]。

1.4.1.3 刺梨多酚 采用超声提取法提取刺梨果实中的多酚[14]。将干燥的刺梨果实粉碎，过50目筛。称取刺梨粉末，液料比100:1，加入70%乙醇，超声功率250w，30℃超声提取 40min，过滤，40℃旋转蒸发仪浓缩，得到粗多酚浸膏。用AB-8大孔树脂装柱上样，上样液浓度 0.7mg·mL-1，上样液 pH 5.9，流速 3mL·min-1；洗脱液浓度70%，洗脱液pH 6.3，流速3mL·min-1进行洗脱，得到洗脱液。再经过旋转蒸发仪蒸干水分，真空干燥得到刺梨多酚粉末，采用Folin-Ciocaltean法测定刺梨多酚纯度[15]。

1.4.2 细胞培养 无菌条件下，将B16细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养，待细胞生长至融合状态，以胰酶消化传代，每2d传代1次。

1.4.3 实验分组 收集对数生长期细胞，调整细胞密度至4×104个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL。37℃、5%CO2饱和湿度环境下孵育24h后，根据前期预实验结果，将细胞分为空白组、正常组、刺梨多糖组（200、400、800、1 600μg·mL-1）、刺梨黄酮组（30、60、120、240μg·mL-1）、刺梨多酚组（40、80、160、320μg·mL-1），阳性对照组（维生素 C 90μg·mL-1）。正常组细胞中加入100μL不含药物的培养基，空白组不接种细胞，代之等量培养基，其余各组分别加入100μL含有相应剂量药物培养基。每组设置3个复孔，于37℃、5%CO2饱和湿度环境下孵育48h。

1.4.4 MTT法测定刺梨不同提取成分对B16细胞增殖活性的影响 按“1.4.3”项下方法处理细胞48h后，弃去培养液，以PBS洗涤1次，每孔加入无血清RPMI-1640培养基 100μL 和 5mg·mL-1的 MTT 溶液 20μL，在37℃、5%CO2饱和湿度环境下继续培养4h后，弃去上清液，每孔加入DMSO溶液150μL，震荡5～10min使结晶充分溶解，酶标仪检测A490，实验重复3次。细胞增殖活性=[（药物处理组A490-空白组A490）/（正常组 A490-空白组 A490）]×100%，计算 IC50。

1.4.5 倒置显微镜观察刺梨不同提取成分对B16细胞形态的影响 收集对数生长期细胞，调整细胞密度至 1×105个/mL，接种于 6 孔板中，每孔 1.5mL，37℃、5%CO2饱和湿度环境下孵育24h后，添加各含药培养基，分组及药物浓度同前，作用48h后，置于倒置显微镜下观察各组细胞形态、大小、生长密度及融合状态等，并拍照记录。

1.4.6 多巴氧化法测定刺梨不同提取成分对B16细胞酪氨酸酶活性的影响 按“1.4.3”项下方法处理细胞48h后，用PBS洗涤两遍，每孔加1%TritonX-100溶液100μL，迅速放入-80℃冰箱冻存1h，随后移至室温下裂解细胞，37℃预温后每孔加入浓度为0.1%的 L-DOPA 100μL，37℃水浴 2h，酶标仪检测 A490，实验重复3次。细胞酪氨酸酶活性=[（药物处理组A490-空白组A490）/（正常组A490-空白组A490）]×100%。采用SPSS 17.0统计软件计算IC50。

1.5 统计学分析 采用 SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用±s表示,多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差异法（LSD-t法），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 刺梨不同部位的提取率和纯度测定 刺梨不同提取成分的提取率差别较大，其中刺梨多糖的提取率最高，可达45.33%，是刺梨黄酮和刺梨多酚提取率的7.56和5.21倍。虽然刺梨黄酮提取率最低，仅为6.00%，但其纯度显著高于刺梨多糖和刺梨多酚，经亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法检测获得的刺梨黄酮纯度为52.50%，分别是刺梨多糖纯度和刺梨多酚纯度的1.56和1.69倍。见表1。

表1 刺梨不同提取成分的提取率及纯度（±s，%）Tab.1 Extraction rate and purity of Rosa roxburghii different extraction parts(±s,%)

表1 刺梨不同提取成分的提取率及纯度（±s，%）Tab.1 Extraction rate and purity of Rosa roxburghii different extraction parts(±s,%)

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2.2 刺梨不同提取成分对B16细胞增殖活性和形态的影响 刺梨的不同提取成分对B16细胞增殖均具有抑制作用，并呈一定的浓度依赖性，和正常组比较，均有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。药物处理 48h后，400、800μg·mL-1的刺梨多糖组B16细胞的增殖活性分别是76.16%和45.01%，与正常组比较，均有统计学差异（P＜0.01）。30μg·mL-1刺梨黄酮组细胞增殖活性为89.14%，当黄酮浓度增加到120μg·mL-1时，B16细胞的增殖活性可下降至48.81%，对细胞增殖的抑制效果是低浓度刺梨黄酮处理组的4.71倍，与正常组比较，具有统计学差异（P＜0.01）。40、80μg·mL-1的刺梨多酚处理48h后，B16细胞的增殖活性分别是84.27%和80.84%，与正常组比较，均具有统计学差异（P＜0.01），其对细胞增殖的抑制效果介于刺梨多糖和刺梨黄酮之间。见表2。处理48h后，刺梨多糖、刺梨黄酮和刺梨多酚抑制B16细胞增殖的IC50分别为649.83μg·mL-1、105.87μg·mL-1、134.16μg·mL-1，其中刺梨黄酮对B16细胞增殖活性的抑制效果最佳，120、240μg·mL-1刺梨黄酮对B16细胞增殖的抑制作用优于维生素C（P＜0.05或P＜0.01）。正常组细胞生长状态良好，形态正常，贴壁牢固，融合度好。不同浓度的刺梨提取物处理之后，细胞密度减少，细胞形态均出现了不同程度的变化，融合度降低，不能相互融合成网状结构，随着药物剂量增加，细胞数量明显减少，碎片增多。见图1。

表2 刺梨不同提取成分对B16细胞增殖活性的影响（±s）Tab.2 Effects of different extracts of Rosa roxburghii on proliferation of B16 cells(±s)

表2 刺梨不同提取成分对B16细胞增殖活性的影响（±s）Tab.2 Effects of different extracts of Rosa roxburghii on proliferation of B16 cells(±s)

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:compared with normal group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with positive control group,#P＜0.05,##P＜0.01.

组别 药物浓度（μg·mL-1） B16细胞增殖活性（%）正常组阳性对照组刺梨多糖0刺梨黄酮刺梨多酚90 200 400 800 1 600 30 60 120 240 40 80 160 320 100 54.29±4.4**93.14±3.21*76.16±5.97**45.01±4.63**#4.60±0.15**##89.14±2.7**83.52±3.74**48.81±3.54**#7.91±1.05**##84.27±2.82**80.84±3.23**45.34±1.84**#10.37±2.46**##

图1 刺梨不同提取成分对B16细胞形态的影响（10×）Fig.1 Effects of different extracts of Rosa roxburghii on the morphology of B16 cells（10×）

2.3 刺梨不同提取成分对B16细胞酪氨酸酶活性的影响 刺梨多糖、刺梨黄酮、刺梨多酚对B16细胞酪氨酸酶活性均具有抑制作用，并呈一定的浓度依赖性，与正常组比较，均具有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。刺梨不同提取成分对细胞酪氨酸酶活性的抑制差异较大，其中刺梨黄酮的效果最好，刺梨多糖最差。处理48h后，400μg·mL-1刺梨多糖组B16细胞酪氨酸酶活性为41.84%，800μg·mL-1刺梨多糖组酪氨酸酶活性仅为3.67%，与正常组比较，均具有统计学差异（P＜0.01）。30μg·mL-1刺梨黄酮组 B16细胞酪氨酸酶活性为76.93%，120μg·mL-1刺梨黄酮组B16细胞酪氨酸酶活性下降为6.43%，其抑制效果是低浓度刺梨黄酮处理组的11.96倍，与正常组比较，均具有统计学差异（P＜0.01），中、高浓度刺梨黄酮组（≥60μg·mL-1）细胞内酪氨酸酶活性显著低于阳性对照（P＜0.01）。40、80μg·mL-1的刺梨多酚处理 48h 后，B16 细胞的酪氨酸酶活性分别是95.96%和46.50%，与正常组比较，均具有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01），中、高浓度刺梨多酚组（≥80μg·mL-1）细胞内酪氨酸酶活性显著低于阳性对照组（P＜0.01），其酪氨酸酶抑制效果介于刺梨多糖和刺梨黄酮之间。处理48h后，刺梨多糖、刺梨黄酮和刺梨多酚抑制细胞内酪氨酸酶活性的IC50分别为 376.13μg·mL-1、57.51μg·mL-1、82.42μg·mL-1，其中刺梨黄酮对B16细胞内酪氨酸酶活性的抑制效果最佳，且刺梨黄酮、刺梨多酚以及高浓度刺梨多糖对酪氨酸酶的抑制效果优于维生素C。见图2。

图2 刺梨不同提取成分对B16细胞酪氨酸酶活性的影响Fig.2 Effects of different extraction parts of Rosa roxburghii on tyrosinase activity in B16 cells

3 讨论

美白是近年来护肤品行业及消费者最热衷追求的护肤功效之一，酪氨酸酶作为黑色素生成的限速酶，其表达和活性与黑色素合成的速度和产量密切相关[16]，近年来以酪氨酸酶为靶点的活性成分筛选在祛斑美白领域中的应用日益广泛。黄少丹等[17]以酪氨酸酶为靶点对中药美白成分进行了筛选，李红艳等[18]通过对酪氨酸酶抑制作用的研究快速筛选出红花中具有酪氨酸酶抑制活性的成分。近年来，无毒高效的天然植物酪氨酸酶抑制剂成为了美白化妆品及皮肤用药的研究热点[19]。严航等[20]研究发现，加8倍量的70%乙醇提取2h，两次提取得到的薏苡仁提取物对酪氨酸酶活性的抑制率达33.3%，具有潜在的美白功效。王国林等[21]测定不同乙醇浓度的洗脱物对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用，其中经MCI柱后体积分数30%乙醇洗脱物对酪氨酸酶活性的抑制最灵敏。本文首先通过水提法、醇提法和超声提取法获得刺梨多糖、黄酮和多酚，随后研究了以上3种提取成分对黑色素瘤B16细胞增殖活性、细胞形态和酪氨酸酶活性的影响，结果表明刺梨的3种提取物均能抑制B16细胞增殖和酪氨酸酶活性，并呈一定的浓度依赖性，其中刺梨黄酮抑制效果最佳，刺梨多酚次之，刺梨多糖效果最差。刺梨黄酮和刺梨多酚对酪氨酸酶活性的抑制程度优于维生素C。本文的研究结果表明，刺梨多糖的提取率最高，可达45.33%，但对B16细胞增殖及酪氨酸酶活性作用效果不佳，猜测可能与多糖未经过纯化，粗提物效果不好有关，后续研究中将进一步优选纯化工艺，提纯后再进行后续酪氨酸酶抑制剂筛选，以提高刺梨多糖利用率。本研究表明，与B16细胞增殖活性实验相比，相同浓度下刺梨提取成分对细胞酪氨酸酶活性的抑制作用更强，提示刺梨黄酮和刺梨多酚可作为高效的酪氨酸酶抑制剂用于后续的产品开发。

黑色素瘤B16细胞作为美白产品的活性筛选模型，可用于美白产品祛斑初步功效的评价。赵京霞等[22]以B16细胞为模型，通过酶学方法研究滋补肝肾方含药血清对细胞酪氨酸酶活性的影响。本文中以B16细胞为模型，检测了刺梨不同提取成分对酪氨酸酶活性的影响，结果表明刺梨黄酮对B16细胞的酪氨酸酶活性具有显著的抑制作用，作用48h时其IC50值可达57.51μg·mL-1。近年来的研究结果表明，众多植物来源的黄酮类化学成分对酪氨酸酶具有显著的抑制作用[23]。付小华[24]研究发现甘草黄酮可有效抑制酪氨酸酶单酚酶与二酚酶的活性。Nquyen等[25]研究发现异叶蒿黄酮能有效抑制酪氨酸酶活性，是皮肤增白剂的潜在来源。本次实验通过醇提法提取刺梨黄酮，并用大孔树脂纯化，制备出的刺梨黄酮纯度较高，为52.50%，表明优化技术较为成熟，具有良好的开发前景，但是得率较低，后续将进一步优化刺梨黄酮提取工艺，提高黄酮得率，为刺梨黄酮的后续开发提供研究基础。

刺梨生长于我国云南、贵州等西南省份山区，尤以贵州资源最为丰富，是贵州的民族特色药材，适应性强、易栽种，具有来源丰富、价格低廉的特点。我国在上世纪80年代开始就对其药理作用进行了较为全面的研究，发现刺梨具有提高免疫、延缓衰老、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗癌、降血脂等功能，但是目前对于刺梨的整体开发利用程度较低[26]。本实验为刺梨提取物，特别是刺梨黄酮的研究奠定了基础，为化妆品行业开发新的美白原料提供了研究思路。