黄连素抑制小鼠CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB通路防治NASH的作用研究

李玲 吕惠卿

1.浙江中医药大学护理学院 杭州 310053 2.浙江中医药大学药学院

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种与胰岛素抵抗和遗传易感性相关的代谢性应激性肝损伤，疾病谱包括单纯性脂肪性肝病、脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）及其相关肝硬化。据统计，美国、欧洲及日本成人中NASH的患病率约为10%～30%[1-3]。近年来研究发现，NASH不再是良性病变，可发展为肝纤维化、肝硬化，甚至急性肝衰竭，从而引起一系列并发症[4]，也是单纯性脂肪肝向肝纤维化进展的关键步骤，但其发病机制尚未完全明确。加强NASH的发病机制及诊治研究，对防治肝纤维化和肝硬化具有重要意义。

趋化因子是具有化学趋化作用的分泌型小分子多肽，在细胞的增殖、分化和凋亡的过程中发挥着重要的作用。肝脏损伤，肝实质炎症、坏死，肝星状细胞激活，细胞外基质沉积被认为是肝纤维化发生的中心环节。Mavier等[5]证实CXC趋化因子配体-12（CXC chemokine ligand-12，CXCL-12）和CXC趋化因子受体-4（CXC chemokine receptor-4，CXCR-4）轴参与肝脏损伤修复。研究还证实，与CXCL-12/CXCR-4轴相关的磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/苏氨酸蛋白激酶（acid threonine protein kinase，AKT）信号通路是维持细胞正常生理功能的信号通路之一，阻断该通路能显著抑制肝星状细胞活化并促进其凋亡[6]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）作为一种重要的转录因子，广泛存在于全身多种细胞，参与机体的炎症反应、免疫反应及细胞增殖与凋亡的过程，研究发现在NAFLD患者及动物模型的肝组织中均存在NF-κB的激活[7-9]。

黄连素又称为小檗碱，是一种从黄连、黄柏和白毛莨等植物中提取的季铵型异喹啉类生物碱。临床研究发现，黄连素联合益肝灵治疗代谢综合征合并NASH取得了良好的效果[10]。本研究试图建立NASH小鼠模型，进一步研究黄连素对NASH小鼠CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB信号通路的影响以及相关机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 雄性SPF级ApoE基因敲除小鼠27只，体质量18～22g，购于南京动物模式研究所[实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2010-0001]，饲养于浙江中医药大学SPF级动物房[实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2013-0184]。饲养条件：每笼 5 只，温度(22±1)℃，湿度 40%～70%，明暗各 12h，每日更换饮水及饲料，保持通风及清洁卫生。适应性饲养1周后，随机分为3组，模型组(9只)、黄连素组（10只）和对照组（8只）。3组小鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组中1只小鼠饲养4周后发现牙齿严重畸形，故弃去。

1.2 主要试剂 高脂高胆固醇饲料配方为：20%蛋白质、50%碳水化合物、21%脂肪和0.21%胆固醇，购于加拿大 Research Diet公司（批号：D12079B）；黄连素购于Sigma-aldrich（上海）贸易有限公司（批号：SLBM9643V）；抗CXCR-4多克隆抗体、抗磷酸化核因子-κB（phosphorylated nuclear factor-κB，pNF-κB）p65多克隆抗体均购于Abcam公司（批号：GR69382-12、3039S-6）；抗CXCL-12兔多克隆抗体购于Santa Cruz公司（批号：SC-28876:1113）；抗 PI3K p85兔多克隆抗体、抗AKT兔单克隆抗体、抗磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，pAKT）兔单克隆抗体、抗NF-κB p65兔单克隆抗体、抗β-actin兔单克隆抗体均购于Cell signaling公司（批号：4257S-6、2938S-0004、4060S-0016、8242S、4070S-12）；山羊抗兔二抗IgG购于麦约尔生物公司（批号：HSA0003）；DAB显色剂、免疫组化两步试剂盒均购于中杉金桥公司（批号：K142717D、WK141514）；Trizol试剂购于美国Invitrogen公司（批号：79407）；逆转录试剂盒购于上海Roche公司（批号：4897030001）。

1.3 主要仪器 化学发光成像系统购于美国Bio-Rad公司；ABI prism 7900 HT fast Real-time PCR system为Biometra公司产品；石蜡切片机购于德国Leica公司；正置双目显微镜为日本Nikon公司产品；荧光显微镜购于日本Olympus公司；荧光定量PCR仪购于AB Applied Biosystem公司。

1.4 动物模型建立 模型组和黄连素组小鼠给予高脂高胆固醇饲料喂养，对照组用普通饲料，各组均连续喂养12周；黄连素组以高脂高胆固醇饲料喂养6周后，每天予以200mg/（kg·d）的黄连素灌胃，持续6周[11]；模型组以高脂肪高胆固醇饲料喂养6周后，每天予以同体积蒸馏水灌胃，持续6周。

1.5 血清指标检测及病理标本制作 造模12周后，末次给予饲料后禁食12h，各组小鼠眼底静脉丛采血，室温静置1h后3 000r/min离心15min，分离血清，-20℃保存，采用日立7180全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）水平。处死小鼠，完整分离肝脏，测量肝脏湿重，计算肝指数，肝指数=肝脏湿重/体重。由肝左叶固定部位取3mm×3mm大小肝组织用于制备冰冻切片，另取3mm×3mm大小肝组织放入10%多聚甲醛，制备肝脏石蜡切片标本，用于病理检查、免疫组化染色，其他部分在液氮中速冻后转入-80℃冰箱保存，用于mRNA检测。

1.6 其他检测指标

1.6.1 肝脏病理学检查 肝组织石蜡切片行HE染色，观察肝组织炎症活动度和纤维化程度，参照美国国立卫生研究院NASH临床研究网络病理工作组评分系统进行NAFLD活动度评分（NAFLD activity score，NAS），NAS的计算选取可恢复性组织学病变指标，包括脂肪变0～3分，小叶内炎症0～2分，肝细胞气球样变 0～2 分，总积分值 0～8 分[12-13]。

1.6.2 Real-time PCR检测肝组织CXCR-4、CXCL-12、PI3K、AKT、NF-κB mRNA 表达 取肝组织约50mg，以Trizol试剂提取总RNA后，依据逆转录试剂盒说明书合成cDNA第一链，荧光定量PCR扩增目的基因的cDNA片段，PCR反应条件为：95℃预变性10min，95℃ 15s，60℃ 1min，共 40 个循环，95℃ 15s，60℃ 15s，95℃ 15s。实验所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。见表1。ΔCT1=对照组目的基因CT值-对照组内参基因CT值，ΔCT2=实验组目的基因CT值-实验组内参基因CT值，ΔΔCT=ΔCT2-ΔCT1。代入公式2-ΔΔCT计算，即得到实验组mRNA 的相对表达量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.6.3 免疫组化检测肝组织CXCR-4、CXCL-12、AKT、pAKT、NF-κB 及 pNF-κB 蛋白表达 石蜡切片常规脱蜡水化，3%H2O2封闭，高压修复，加封闭液后，滴加兔抗鼠多克隆抗体CXCR-4（1:50）、CXCL-12（1:50）、pNF-κB（1:100），兔抗鼠单克隆抗体AKT（1:400）、pAKT（1:50）、NF-κB（1:800），4℃过夜，次日加生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育30min，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，光镜下观察。

1.6.4 Western blot检测肝组织 CXCR-4、CXCL-12、PI3K、AKT、pAKT、NF-κB 及 pNF-κB 蛋白表达 肝组织总蛋白经SDS-PAGE电泳后，采用半干电转移将蛋白质分子转移到PVDF膜上，置于含5%牛血清白蛋白的封闭缓冲液中室温下封闭1.5h，TBST洗膜3次，加入一抗，4℃反应过夜。PI3K、AKT、NF-κB、β-actin抗体稀释比例均为 1:1 000，CXCR-4、CXCL-12、pNF-κBp65抗体稀释比例均为1:500，pAKT抗体稀释比例为1:2 000，。次日TBST洗膜3次，加入稀释比例为1:5 000的二抗。室温下孵育1h，TBST洗膜3次，ECL试剂盒显色，化学发光成像系统采集图像并进行分析。

1.7 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，检验数据正态性，符合正态分布的计量资料采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间比较采用LSD-t检验；非正态分布数据组间比较采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量及血脂、肝功能指标比较 12周时模型组小鼠体质量、ALT、AST、TC、TG水平明显高于对照组（P＜0.01）；黄连素组小鼠体质量低于模型组，但差异无统计学意义（P＞0.05），与对照组比较也无统计学差异（P＞0.05），黄连素组小鼠的 ALT、AST、TC水平明显低于模型组（P＜0.05），TG水平虽然低于模型组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠体质量及血脂、肝功能指标比较Tab.2 Comparison of body mass,blood lipid and liver function indexes in each group

2.2 各组小鼠肝脏病理学观察 HE染色显示，对照组小鼠肝小叶结构完整，肝索由中央静脉向外周呈放射状，肝细胞形态均匀，细胞质均质红染，细胞内未见脂滴，其余均无异常发现。随着造模时间延长，模型组肝脏脂肪变性程度逐渐加重，肝索紊乱，肝窦变小，肝细胞体积增大，呈圆形，细胞质内有大量圆形空泡，将细胞核挤到一侧，部分可见气球样变性。见图1。模型组的NAS总分均超过5分，达到了NASH的诊断标准。三组间比较，脂肪变、气球样变、小叶内炎症、NAS总分均有统计学差异（P＜0.01）。见表3。进一步比较提示，黄连素组气球样变、小叶内炎症较模型组减轻，NAS总分也低于模型组（P＜0.05），但脂肪变与模型组比较无统计学差异（P＞0.05）。

图1 各组小鼠肝脏切片病理学形态比较（HE染色，400×）Fig.1 Pathological morphological comparison of liver slices in each group(HE staining,400×)

表3 各组小鼠肝脂肪变、气球样变、小叶内炎症及NAS比较Tab.3 Liver fat change,balloon-like change,intra-lobular inflammation and NAS comparison in each group

2.3 各组小鼠 CXCR-4、CXCL-12、PI3K、AKT、NF-κB mRNA表达比较 研究结果显示，模型组CXCR-4、CXCL-12、PI3K、AKT、NF-κB mRNA 表达水平均高于对照组（P＜0.05）,黄连素组的上述指标则明显低于模型组（P＜0.05）。见表 4。

表4 各组小鼠 CXCR-4、CXCL-12、PI3K、AKT、NF-κB mRNA 表达比较Tab.4 Comparison of expression of CXCR-4,CXCL-12,PI3K,AKT and NF-κB mRNA in each group

2.4 免疫组化检测各组小鼠肝组织CXCR-4、CXCL-12、AKT、pNF-κB蛋白表达 对照组小鼠肝组织中CXCR-4仅在肝窦内皮细胞弱表达；模型组CXCR-4在肝窦内皮细胞、中央静脉、肝细胞的细胞质或细胞膜均呈阳性表达，染色呈棕黄色；黄连素组肝窦内皮细胞、肝细胞的细胞质或细胞膜也呈阳性表达，染色呈棕黄色，但镜下观察可见，阳性表达细胞少于模型组。对照组CXCL-12在肝窦内皮细胞、中央静脉周围有弱表达；模型组CXCL-12在肝窦内皮细胞、肝细胞的细胞质或细胞膜呈阳性表达，染色呈棕黄色；黄连素组CXCL-12在肝窦内皮细胞、肝细胞的细胞质或细胞膜也呈阳性表达，染色呈棕黄色，但镜下观察可见，阳性表达细胞少于模型组。对照组pAKT在肝窦内皮细胞弱表达；模型组pAKT在肝窦内皮细胞、肝细胞的细胞质或细胞膜呈阳性表达，染色呈棕黄色；而黄连素组pAKT在肝窦内皮细胞、肝细胞的细胞质或细胞膜也呈阳性表达，染色呈棕黄色，但镜下观察可见，阳性表达细胞少于模型组。对照组pNF-κB无阳性表达；模型组肝窦内皮细胞、肝细胞的细胞质或细胞核染色呈阳性表达，染色呈棕黄色；黄连素组pNF-κB在肝窦内皮细胞、肝细胞的细胞质或细胞核也呈阳性表达，染色呈棕黄色，但镜下观察可见，阳性表达细胞少于模型组。见图2-5。

2.5 各组小鼠肝组织 CXCR-4、CXCL-12、AKT、pAKT、NF-κB、pNF-κB 蛋白表达比较 Western blot结果表明，模型组CXCR-4、CXCL-12蛋白表达水平高于对照组（均 P＜0.05），pAKT 和 pNF-κB 蛋白表达水平显著高于对照组（均P＜0.01）；黄连素组CXCR-4、CXCL-12、pAKT蛋白表达水平低于模型组（均P＜0.05），而pNF-κB蛋白表达水平显著低于模型组（P＜0.01）。见图 6-12。

图2 各组小鼠CXCR-4表达比较（400×）Fig.2 Comparison of CXCR-4 expression in each group(400×)

3 讨论

CXCL-12/CXCR-4生物轴在介导炎症及免疫反应、维持胚胎发育、调控造血、诱导血管生成、肿瘤侵袭转移等多种生理和病理过程中发挥着重要作用[14-15］。其通路主要包括PI3K/AKT信号传导途径、丝裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）途径和两面神激酶/信号传导及转录激活因子（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）途径。在慢性肝疾病中，肝星状细胞的激活与转化是肝纤维化形成的关键，而PI3K/AKT信号通路是肝星状细胞活化过程中非常重要的部分，阻断该通路能显著抑制肝星状细胞活化并促进其凋亡[6]。姚鹏等[16]采用丝裂霉素诱导肝干细胞凋亡，以PI3K/AKT信号通路特异性抑制剂LY294002干预可抑制肝干细胞凋亡。蔡凤桃等[17]应用不同浓度眼镜蛇蛇毒和LY294002可以降低pAKT表达水平，促进肝纤维化。

图3 各组小鼠CXCL-12表达比较（400×）Fig.3 Comparison of CXCL-12 expression in each group(400×)

图4 各组小鼠pAKT表达比较（400×）Fig.4 Comparison of pAKT expression in each group(400×)

图5 各组小鼠pNF-κB表达比较（免疫组化，400×）Fig.5 Comparison of pNF-κB expression in each group(immunohistochemistry,400×)

图6 各组小鼠肝组织CXCR-4蛋白表达比较Fig.6 Comparison of the expression of CXCR-4 protein in liver tissues in each group

图7 各组小鼠肝组织CXCL-12蛋白表达比较Fig.7 Comparison of the expression of CXCL-12 protein in liver tissues in each group

图8 各组小鼠肝组织PI3K蛋白表达比较Fig.8 Comparison of the expression of PI3K protein in liver tissues in each group

图9各组小鼠肝组织AKT蛋白表达比较Fig.9 Comparison of the expression of AKT protein in liver tissues in each group

图10 各组小鼠肝组织pAKT蛋白表达比较Fig.10 Comparison of the expression of pAKT protein in liver tissues in each group

图11各组小鼠肝组织NF-κB蛋白表达比较Fig.11 Comparison of the expression of NF-κB protein in liver tissues in each group

图12 各组小鼠肝组织pNF-κB蛋白表达比较Fig.12 Comparison of the expression of pNF-κB protein in liver tissues in each group

现有研究发现NAFLD与NF-κB有密切联系，在NAFLD患者及动物模型的肝组织中均存在NF-κB的激活[7-9]，NF-κB信号通路的激活能促进炎性细胞因子的表达,参与肝脏的炎性反应、纤维化与凋亡[18]。本研究结果发现，CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB通路各基因在模型组小鼠的肝脏中表达显著高于对照组，而PI3K和NF-κB蛋白质水平虽有升高，但与对照组比较无统计学差异，说明可能存在基因翻译过程中的修饰或降解，也可能在通路的下行传导过程中更能发挥作用的是活化的PI3K和NF-κB。PI3K/AKT的活化能抑制细胞凋亡、保护组织和器官，其中AKT的磷酸化是该通路的中心环节[19]。而NF-κB的活化促进活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）及炎症因子的分泌，ROS参与的氧化应激及脂质过氧化，可以活化库普弗细胞及肝星状细胞，可见NF-κB活化后介导的氧化应激及炎症反应之间存在相互作用，共同加速NAFLD的进展[20]。因此笔者推测，CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB通路的激活可能在NASH发病中起到推波助澜的作用。

以往的研究显示，黄连素具有抗炎、调脂、改善胰岛素抵抗的作用，还能抑制细胞凋亡，可用于腹泻和消化性溃疡的治疗[21]。其他研究则发现，黄连素可降低高血脂大鼠的血脂水平，抑制肝脏脂质过氧化过程，减少肝脏损伤[22]。临床调查显示，黄连素主要成分小檗碱的补充剂可降低2型糖尿病患者的ALT和AST水平[23-24]。欧意桃等[25]的研究也发现黄连素能降低ALT和AST的水平。张辉等[26]临床研究发现甘草酸二铵肠溶胶囊联合黄连素可抑制白细胞介素-6的分泌，从而改善NASH患者肝功能及脂代谢。本研究也证实，黄连素组小鼠体质量、TC、ALT、AST指标及NAS评分均低于模型组，说明黄连素可作为治疗NASH的药物，能有效治疗NAFLD。黄连素能够通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活，抑制高糖导致的肾脏系膜细胞增殖[27]。黄连素还可显著下调HepG2细胞中pAKT的表达，表明其可抑制AKT通路激活[28]。Pazhang等[29]在对乳腺癌凋亡的研究中发现，黄连素可抑制NF-κB的表达。黄连素还能通过NF-κB信号通路减少肝癌细胞肿瘤坏死因子诱导的血管内皮生长因子表达上调[30]。

为进一步探讨黄连素治疗NASH的作用机制，本研究采用了Real-time PCR、免疫组化和Western blot等方法，从细胞、基因和蛋白水平观察黄连素对CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB通路的影响。结果发现黄连素能下调 CXCL-12、CXCR-4、PI3K、AKT、NF-κB mRNA 的表达，抑制 pAKT、pNF-κB 蛋白的活化，减少 CXCL-12、CXCR-4、pAKT、pNF-κB蛋白的表达，说明黄连素主要通过CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB通路抗炎、抗凋亡、抗肝细胞纤维化而治疗NASH。但本研究的不足之处主要有：（1）本实验免疫组化结果仅为肉眼观察所得，未作半定量检测和统计学分析；（2）由于造模的周期较短，未能建立NASH向纤维化发展的模型，因此，肝星状细胞活化后转化生长因子-β、胶原纤维等纤维化的指标未能得到验证，黄连素抗纤维化的作用通路尚待验证；（3）黄连素通过抑制CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB通路的激活治疗NASH的作用还缺乏体外实验和临床研究验证，以上可为日后深入研究此通路的关键节点和寻找阻断此通路的类似药物提供了新的研究方向。