霍山石斛标本的固色与塑化方法探讨

刘昌利，何晓梅，李 刚，张丽君

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.安徽省植物细胞工程技术中心，安徽 六安 237012)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)作为国家一级保护植物和安徽省名贵的道地药材[1，2]，教学和研究中多是腊叶标本。由于腊叶标本失水失色后不能很好保持植物的原生态形状和色泽，无鲜活感，且标本脆薄易破损、易氧化变色、不利于长期保存。植物塑化技术利用聚乙二醇置换生物组织中的水分[3]，既能保持植物原有的状态，也可以延长标本的使用寿命。且塑化试剂价廉易得，标本制作方法简单易行，制成的标本无毒无味经久耐用。为使石斛标本具有更为逼真的中药色泽特征，以满足教学、科研和科普宣传需要。本试验基于植物固色和塑化技术[4，5]，探讨霍山石斛的固色和塑化工艺，建立了霍山石斛标本的制作新方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

霍山石斛采自皖西学院石斛栽培标准化示范基地。硫酸铜(上海龙昕化工有限公司，分析级AR)、醋酸铜(天津市兴复精细化工研究所， AR)、氯化亚锡和甲醛(无锡市展望化工试剂有限公司，AR)、无水乙醇(上海振兴化工一厂，AR)、丙三醇(西陇化工股份有限公司，AR)、蜂蜡(天津市大茂化学试剂厂，AR)、聚乙二醇(PEG)200与聚乙二醇(PEG)400(天津博迪化工股份有限公司，AR)。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集

采集霍山石斛，修剪去烂叶、黄叶及部分小枝，保持植株完整，洗净石斛根部，用蒸馏水冲洗晾干备用。采集正常生活状态、开花或结有果实的霍山石斛植株，以制作生活史不同阶段的标本。

1.2.2 标本固色

霍山石斛的根白色，茎、叶和果实呈绿色，花黄色。为保持标本不同部位的颜色，选择0%、1%、3%、5%、7%的氯化亚锡溶液对石斛根固色[3，4]，固色30 min，每5 min观察1次。茎、叶和果实的固色选择硫酸铜和醋酸铜溶液[4]，将准备好的标本分成2组，分别置于0%、3.5%、5%、7%、10%、14%的硫酸铜溶液，0%、5%、7%、10%、14%、20%浓度的醋酸铜溶液中，均固定4 d，期间每6～8 h观察1次，当石斛植株由绿色变为黄色再由黄色变成绿色为止，取出完成固色步骤的标本洗净晾干备用。完成石斛植株根茎叶和果实部分的固色后，仅将石斛花小心浸入花朵专用固色液中固色。本实验以7%、10%的硫酸铜，10%、14%的醋酸铜，5%、7%的氯化亚锡溶液分别作为花的固色液对花固色4 d，实验中第1 d每3～6 h观察一次，第2～4 d每6 h观察1次，仅记录有变化的时间点[4，6]。为更好保护石斛花的颜色，在茎叶、果实固色中对有花的石斛植株不要将花浸入硫酸铜或醋酸铜固色液中，在花柄处拴上细线，将花朵悬挂固定在根、茎叶(果实)所用固定液液面上，动作轻柔避免损伤石斛花。为方便操作标本的固色顺序是依次花、根、茎叶和果实。

1.2.3 标本塑化

将固色处理好的标本置于无水乙醇中浸泡3 h进行脱水，脱水完成后分成A、B两组再分别进行塑化，塑化液的配置与塑化步骤见表1[7]，A组随着聚乙二醇分子量和浓度的增加，塑化时间逐步延长，B组塑化时间基本不变。对完成塑化后的标本进行简单的姿态整理后放入真空干燥箱(40 ℃)干燥24 h，然后将完全干燥的标本接受阳光照射3个月(6～8月)，通过观察标本的颜色变化以比较A、B两组方法抗紫外线损伤及光氧化能力的大小。干燥好的塑化标本存放于标本瓶中用蜂蜡密封后避光保存即可。

表1 标本的塑化操作

注：保存液即醋酸铜结晶加入50%冰醋酸溶液中，配制成的饱和溶液。

2 结果

2.1 霍山石斛根的固色效果

氯化亚锡对石斛根的固色速度很快，1%浓度组对根的固色5 min内即可完成，且随时间延长1%氯化亚锡处理的根颜色基本无变化，但外观上标本根的白色度不如3%、5%和7%氯化亚锡的固色效果好，综合考虑采用7%氯化亚锡固色5 min效果更好见表2。

表2 不同浓度氯化亚锡溶液对根的固色效果

2.2 霍山石斛茎叶与果实的固色效果

不同浓度硫酸铜、醋酸铜溶液固色石斛标本4 d，结果见表3。对石斛茎叶和果实固色效果较好的固色液是7%和10%硫酸铜溶液，14%和20%的醋酸铜溶液，固色时间2～3 d。由于第4 d没有变化故在表中不再记录。

表3 硫酸铜溶液对茎叶的固色效果

2.3 霍山石斛花的固色效果

硫酸铜(7%、10%)、醋酸铜(10%、14%)和氯化亚锡(5%、7%)溶液对花的固色实验结果如表5显示，7%氯化亚锡、10%醋酸铜和7%硫酸铜溶液对花的固色效果较好，其他组的固色效果较差。具体固色效果是：7%氯化亚锡>10%醋酸铜>7%硫酸铜，固色时间3～6 h为宜。

2.4 标本的塑化效果

A组标本石斛茎叶绿色，但茎缺少生活状态的透明感，叶片有皱缩现象；B组标本颜色自然，叶片舒展无脱落，茎绿色略有透明感，与生活状态的石斛几乎没有差别，B组的塑化效果好于A组。将塑化好的A、B两组标本、固色后没有塑化的标本和新鲜石斛各选5株裸露放置在室内朝南的窗户下暴晒3个月，如表6所示。3个月后A组标本褪色，B组标本颜色基本无变化。

表4 醋酸铜溶液对茎叶的固色效果

表5 三种溶液对石斛花的固色效果

表6 光照对标本的影响

3 讨论

对比植物传统的腊叶标本、浸制标本，植物塑化标本是一种新的标本类型，它是在新鲜植物进行固色处理的基础上，用聚乙二醇替代石斛标本体内的水分并达到防腐固定的作用[3，8]。

塑化标本制作中固色液的选择非常重要，它直接影响到塑化后标本颜色是否生动逼真。绿色植物标本固色液一般都是用硫酸铜或者醋酸铜，通过Cu2+离子将叶绿素中Mg2+置换出来，由于进入叶绿素分子中的Cu2+稳定，所以固色后标本的颜色稳定，以后无论是制作腊叶标本、浸制标本还是塑化标本，只要保管得当其颜色可长久保持、不易褪色[4，8]。

以硫酸铜、醋酸铜溶液固色石斛标本实验中标本颜色由绿变黄，是叶绿素中Mg2+被交换出来、再由黄变绿，是Cu2+逐步进入叶绿素分子的核心结构中替换Mg2+ [4，9]。当铜离子完全替换镁离子后石斛呈绿色，完成了标本的固色。实验中茎叶的固色时间2～3 d，与车前草的固色时间相同，如要缩短固色时间可尝试进行水浴加热[10]。

本实验采用7%和10%硫酸铜溶液，14%和20%的醋酸铜溶液对标本茎、叶和果实固色的效果差别不大，但鉴于后续塑化中要用到冰醋酸，建议采用醋酸铜溶液固色。这是因为硫酸铜中的硫酸根与冰醋酸结合，溶液酸性增强，植物体的内部结构易受破坏，塑化后标本易褪色变黄，从而影响颜色的稳定和塑化效果[6]。

现有报道中对植物的黄花多是采用50%醋酸加热至颜色不再变化后取出[8，11]。本实验尝试50%醋酸加热固色标本，但霍山石斛花小，花瓣薄，出现花朵被烫熟萎蔫的现象，效果不好。从方便对石斛根茎叶、果实的整体固色角度出发，比较了硫酸铜、醋酸铜、氯化亚锡溶液对花的固色效果，结果显示固色效果是7%氯化亚锡>10%醋酸铜>7%硫酸铜，这3组总体差别不大，但它们对黄花的固色原理并不清楚。

植物白色部分的固色通常使用亚硫酸溶液浸泡[4]，但考虑到亚硫酸溶液固色时间长，且固色后取出的标本需要日光下长时间暴晒，标本在变白的同时也受到很大的伤害[8]。由于石斛人工栽培基质含大量树皮，石斛根部呈深褐色，试验中也是偶然将石斛根部放于固色花的氯化亚锡中，发现氯化亚锡对根的固色速度快效果好，但其机理尚不清楚。

聚乙二醇(PEG)是一种水溶性高分子化合物，它所呈现的形态与分子量大小密切相关，当分子量200～700时表现为无色通明的液体状态，分子量1000～2000时为白色蜡质半固体。本试验参考李紫薇、陆海峰等人报道，实验中仅选用了分子量200和400的聚乙二醇[3，7]，而张宏意报道在小草本、亚灌木、灌木和乔木等绿色植物塑化中以分子量600的聚乙二醇效果最好[6]，虽然霍山石斛属兰科植物较灌木柔弱纤细，但后续如开展相关研究应将聚乙二醇的分子量设定在200～700[3]。

本方法的不足之处在于标本的制作时间偏长，约7～8 d，后续试验建议固色阶段通过水浴加热缩短固色时间[10]，并通过尝试提高聚乙二醇的分子量，增大聚乙二醇浓度来改进塑化液配方缩短塑化时间[3]。

综上可见石斛花和根均选用7%氯化亚锡分别固色5 min和3～6 h；茎叶和果实固色液选用14%和20%的醋酸铜溶液均可，固色时间2～3 d。塑化以分子量400的聚乙二醇为主，延长20%、60%聚乙二醇(分子量200)和60%聚乙二醇(分子量400)替换水分子的时间至12 h塑化效果更好。