银屑病患者皮损间充质干细胞环状RNA表达异常研究

刘瑞风 杨晓红 梁见楠 张开明

030009太原市中心医院皮肤科

银屑病是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病，严重影响患者的身心健康和生活质量。因此，探究其发病原因及寻找有效治疗靶点非常重要。研究发现，银屑病患者皮损间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）细胞因子分泌、免疫调节功能及基因表达均有异常［1⁃4］。环状RNA分子（circRNA）是近年来发现的一类新的非编码调控RNA，已证实其参与许多生物学过程和人类疾病［5⁃6］。我们用RNA测序法检测银屑病患者皮损及健康对照皮肤MSC中circRNA表达，并进行详细的生物信息学分析，从分子水平探讨circRNA在银屑病发病中的作用。

材料和方法

一、对象与材料

1.研究对象：本研究经太原市中心医院伦理委员会批准（2014010），所有受试对象均签署知情同意书。银屑病患者组15例，男8例，女7例；进行期7例，静止期8例；年龄13～65岁，病程10 d至20年；皮损范围5%～80%，均为太原市中心医院皮肤科临床及病理确诊为寻常性银屑病的门诊患者，就诊前6个月内局部及全身未使用过糖皮质激素、维A酸类药物、免疫抑制剂及光疗。所有患者均依据银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）评估，PASI分值10.33±3.26（范围1.8～15.0）。对照组15例，取自我院泌尿外科和整形外科手术切除的正常皮肤，性别、年龄与患者组1∶1匹配（年龄±2岁），经常规体检无系统性疾病，入选时禁用药条件同患者组。

2.主要试剂与仪器：DMEM/F12培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司），Dispase酶Ⅱ、胰蛋白酶、碱性成纤维细胞生长因子及B27添加剂（美国Sigma公司），circRNA富集试剂盒（上海云序生物科技有限公司），总RNA文库预处理试剂盒（美国Illumina公司），Trizol、SuperScriptⅢ逆转录酶（美国Invitrogen公司），EPICS⁃XL型流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；BioAnalyzer 2100仪器（美国Agilent公司）；ViiA 7实时PCR系统（美国Applied Biosystems公司）。

二、方法

1.皮肤MSC的分离、培养及鉴定：切取银屑病患者1.5 cm×1 cm皮损，健康对照组取同样大小的正常皮肤。皮肤MSC的分离、培养及流式鉴定方法同文献［1⁃2］。倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，细胞生长近90%融合状态时用0.25%胰酶消化传代。细胞传至第5代，收获细胞，分别取2×105个细胞与异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和HLA⁃DR单克隆抗体室温避光反应30 min，用PBS洗涤后进行流式细胞仪分析、鉴定。

第5代MSC分别用脂肪、骨及软骨诱导分化培养基培养。脂肪细胞分化10 d后，用4%甲醛固定，60%异丙醇洗涤，并用油红O染色。成骨分化3周后，用4%甲醛固定细胞并用2%茜素红染色。成软骨分化21 d后，4%多聚甲醛固定，OCT包埋，切成5 μm切片，甲苯胺蓝染色。

2.RNA文库的制备及测序：每组15例标本随机分为3个亚组，每亚组5个标本，进行circRNA测序。使用每个亚组的总RNA制备circRNA文库，包括以下步骤：提取总RNA 5 μg，使用circRNA富集试剂盒富集circRNA；使用TruSeq Stranded总RNA文库预处理试剂盒预处理RNA，构建测序文库；使用BioAnalyzer 2100仪器进行文库质控和定量。根据Illumina测序说明，将文库变性为单链DNA分子，在Illumina流动池上捕获，原位扩增为簇，并在Illumina HiSeq测序仪上进行150循环测序。circRNA测序由上海云序生物科技有限公司完成。

3.测序数据分析：经过Illumina HiSeq测序仪测序，使用CIRI软件［7］进行circRNA检测和鉴定，并使用circBase数据库［8］对所鉴定的circRNA进行注释，对数据进行标准化，使用t检验进行两组样品的差异circRNA鉴定，通过倍数变化和P值进行筛选，选择差异倍数 ≥2，P＜0.05的circRNA作为差异circRNA。对差异circRNA的来源基因进行GO功能分析和KEGG通路分析，并使用microRNA靶基因预测 软 件 TargetScan 和 miRanda［9⁃10］进 行 circRNA ⁃microRNA相互作用预测。

4.对挑选的差异circRNA注释和功能预测：挑选7个差异较大的circRNA构建circRNA⁃microRNA相互作用网络并进行生物信息学分析。

5.实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT⁃PCR）验证circRNA及microRNA的表达：对上述网络中的7个circRNA分子，以GAPDH作为内参，使用ViiA 7实时PCR系统进行qRT⁃PCR验证。用Trizol试剂分别提取30例样本（银屑病皮损和正常皮肤MSC各15例）总RNA，用SuperScriptⅢ逆转录酶合成cDNA。从circBase数据库得到circRNA序列。引物序列见表1。数据采用2⁃△△Ct方法分析，以±s表示。

为了验证circRNA⁃microRNA相互作用网络中microRNA的表达，根据与这7个circRNA结合位点的数量，挑选了3个结合位点数量最多的microRNA（hsa⁃miR⁃4490，hsa⁃miR⁃654⁃3p和hsa⁃miR⁃423⁃5p）进行qRT⁃PCR分析。管家基因U6作为内参，基因表达变化采用 2⁃ΔΔCt计算。ΔCt=Ct目的基因-Ct内参；ΔΔCt= ΔCt患者组- ΔCt对照组。引物序列见表2。

表1 circRNA引物序列

表2 microRNA引物序列

三、统计学方法

分位数归一化和后续的数据处理使用R软件包>进行（ttps：//www.r⁃project.org/）。所有其他统计数据采用GraphPad Prism 5.0软件分析。患者组和对照组qRT⁃PCR验证采用两独立样本t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、皮肤MSC的培养和鉴定

流式细胞仪分析结果显示，患者组和对照组皮肤MSC表面抗原均高表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，而 CD34、CD45 及HLA⁃DR表达阴性（图1）。经成脂、成骨、成软骨诱导后，皮肤MSC成功分化为相应的细胞和组织（图2），分离培养的细胞符合MSC的鉴定标准［11］。

二、皮肤MSC的circRNA表达谱

共检测到6 323个circRNA，其来源基因的染色体位置分别为：外显子（3 881，61%），内含子（554，9%），正义链重叠区（1 035，16%），反义链（747，12%），基因间隔（106，2%），见图 3A。在这些circRNA中，circBase数据库中包含2 810个；286个以往被研究者报道过，但不包含在circBase数据库中；3 227个以往没有被报道过，是首次发现。另外，在6 323个circRNA中，3 499个仅在银屑病皮损中表达，而1 385个仅在正常皮肤中表达，只有1 439个在两者中均有表达，见图3B。

根据变化倍数（≥2.0）和t检验结果（P ＜0.05），共鉴定出129个差异表达circRNA。与对照组相比，患者组中123个表达上调，6个表达下调。火山图（图3C）和聚类图（图3D）显示出两组间circRNA表达的差异。CircRNA测序数据已上传到美国国家生物技术信息中心基因表达数据库（GSE81106）。

三、circRNA预测和注释

挑选7个表达差异较大的circRNA，通过microRNA靶基因预测软件进行差异circRNA⁃microRNA相互作用预测，它们与microRNA的相互作用网络见图4。与这7个差异circRNA关系密切的银屑病相关microRNA包括，miR⁃17⁃5p、miR⁃30e⁃5p、miR⁃142⁃3p/5p、miR⁃369⁃3p、miR⁃184、miR⁃4490、miR⁃654⁃3p和miR⁃423⁃5p等，它们之间存在相互作用。

四、qRT⁃PCR验证结果

皮肤MSC来源的7个circRNA均在患者组高表达（图5A），与RNA测序结果一致。其中，仅chr14：50053483|50329358和 chr5：170610199|170632616在两组中的表达差异有统计学意义（t=3.182、7.615，P=0.033、0.001）。根据预测的 circRNA⁃microRNA相互作用网络，挑选与这7个circRNA结合位点数量最多的3个microRNA，结合位点数量见图5B。随后，采用qRT⁃PCR方法检测了患者组及对照组各15例标本中3个microRNA的表达，证实这3个microRNA在皮肤MSC中存在，并发现它们在银屑病皮损中低表达（t=3.993、3.217、2.918，P=0.016、0.032、0.043），见图5C。

图4 circRNA注释与功能预测 7个差异表达的circRNA与microRNA相互作用网络，黄色圆圈代表circRNA，绿色三角形代表microRNA

讨 论

circRNA是区别于传统线性RNA的一类新型非编码调控RNA。它们表达丰富，在进化上高度保守，具有组织和/或发育阶段特异性［5］，可以与RNA相关的蛋白质结合形成RNA-蛋白复合物，调节转录；且富含microRNA结合位点，在细胞中起到microRNA海绵的作用［12］，进而解除microRNA对其靶基因的抑制作用［13⁃14］，提高靶基因的表达水平，这一作用机制被称为竞争性内源RNA机制。通过与疾病关联的microRNA相互作用，circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。

图5 qRT⁃PCR验证circRNA及microRNA 5A：7个差异表达的circRNA测序及PCR验证图；5B：每个circRNA上microRNA结合位点的数量；5C：circRNA⁃microRNA互作网络中挑选的3个microRNA的PCR验证结果，a：P＜0.05。每组均为15份标本

我们发现，银屑病患者皮损MSC circRNA表达异常，并报告了3 227个新的circRNA。我们共检测到6 323个circRNA，其中大部分来自外显子（61%），与以往报告的结果一致［12］。患者组与对照组相比，有129个circRNA呈差异表达。为了揭示这些circRNA的作用，在这些差异表达的circRNA中挑选了7个差异倍数较大的circRNA构建了circRNA⁃microRNA相互作用网络（图4）。此网络图表明，这些circRNA与以下microRNA关系密切，包括miR⁃17⁃5p、miR⁃30e⁃5p、miR⁃142⁃3p/5p、miR⁃369⁃3p、miR⁃184、miR⁃4490、miR⁃654⁃3p和miR⁃423⁃5p。值得一提的是，已有文献报道miR⁃17⁃5p、miR⁃30e⁃5p和miR⁃142⁃3p/5p在银屑病皮损中差异表达，且miR⁃142⁃3p明确参与表皮的炎症［15］；银屑病患者血清和皮损中的miR⁃369⁃3p表达均升高，在皮损中的水平与疾病严重程度呈正相关［16］。此外，miR⁃184在银屑病皮损中表达上调，并直接影响其他microRNA的表达，可能在角质形成细胞相关疾病中发挥独特的作用［17］。以上结果均提示，circRNA可能通过吸附这些与银屑病相关的microRNA从而解除其对靶基因的抑制作用，使靶基因表达升高，进一步参与银屑病的发病。为了证实这些microRNA的真实存在，我们挑选其中3个采用qRT⁃PCR进行验证，结果表明，它们不但在皮肤中存在，而且在银屑病患者皮损表达异常（图5C）。

本研究结果证实，银屑病皮损MSC的circRNA表达异常。通过详细的生物信息学分析，我们认为circRNA参与了银屑病的发病。本研究结果及进一步的分子机制深入探讨将为银屑病发病机理研究及寻找新的治疗靶点提供新思路。本课题只研究了皮肤MSC的circRNA表达，没有研究这些寡核苷酸在角质形成细胞及免疫细胞中的表达，并且没有进入深入的机理分析。我们目前正在进行更广泛和深入的研究，来阐明circRNA在银屑病发病中的作用。