银屑病皮损CD8αα+T细胞表型鉴定

张洋洋 李冰 王刚

710032西安，第四军医大学西京皮肤医院

银屑病是以T细胞免疫紊乱为主的慢性炎症性皮肤病，发病机制尚未阐明。目前普遍认为，CD4+T细胞过度活化是银屑病免疫学发病机制的中心环节，其中CD4+T细胞活化后产生的白细胞介素17（IL⁃17）是介导银屑病发病的关键细胞因子［1⁃2］。近年研究发现，CD8+T细胞也可以分泌IL⁃17A，且银屑病患者皮损也有CD8+T细胞浸润［3⁃4］。近年研究发现，CD8+T细胞分群更复杂且发挥的功能更丰富。除了细胞毒性T细胞外，CD8+T细胞中还存在发挥负向免疫调控功能的CD8+调节性T细胞（CD8+Treg）和分泌IL⁃17的Tc17细胞。CD8+Treg细胞参与多种自身免疫性疾病的发病，包括系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、多发性硬化等［5］。Tc17细胞在银屑病、风湿性关节病中也发挥重要作用［6］。本研究探究CD8+T细胞在银屑病中发挥的作用，为CD8+T细胞在银屑病等炎症性皮肤病的机制研究奠定基础。

材料和方法

一、材料

1.皮肤标本：银屑病皮损标本来自第四军医大学西京皮肤医院2017年1-12月明确诊断的8例进行期斑块状银屑病，男女各4例，年龄24～50岁，银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI评分）13.2～22.7，均数为18.3，近3个月未使用系统性药物，近1周未使用外用药物及光疗。健康对照皮肤取自8例与银屑病组年龄、皮损取材部位匹配的西京医院整形外科手术剩余皮肤，男女各4例，年龄23～46岁。本研究通过第四军医大学西京医院医学伦理委员会批准（KY20172030⁃1），受试者均签署知情同意书。

2.主要试剂：兔抗人CD8α单抗、小鼠抗人CD8α单抗、小鼠抗人CD3单抗、小鼠抗人CD56单抗、小鼠抗人CD11c单抗、小鼠抗人Foxp3单抗、小鼠抗人CD25单抗、兔抗人CD122多抗、兔抗人CD103单抗、兔抗人CCR7单抗、Alexa Fluor 488-山羊抗兔、Cy3-山羊抗鼠、Alexa Fluor 488-驴抗羊二抗（美国Abcam公司），小鼠抗人CD8β单抗（美国Santa Cruz Biotechnology公司），小鼠抗人CD45RA单抗（美国Biolegend公司），山羊抗人IL⁃17A抗体（美国R&D Systems公司）、山羊血清（美国Boster Biological Technology公司）。Hochest为上海碧云天生物技术有限公司产品。

二、方法

1.免疫荧光：取银屑病皮损、健康对照皮肤组织，4%甲醛固定，石蜡包埋、切片，常规脱蜡至水，高压修复，于山羊血清中室温孵育30 min，分别滴加50 μl稀释后的 CD8α、CD3、CD56、CD11c、CD8β、Foxp3、CD25、CD122、CD103、CCR7、CD45RA、IL⁃17A一抗混合液（稀释比例按说明书），4℃过夜。次日室温复温1 h，滴加相应的二抗复合物50 μl（1∶200），室温放置 45 min，洗涤液冲洗，滴加Hochest复合物（1∶1 000），室温放置10 min，洗涤液反复冲洗，甘油封片。激光共聚焦显微镜（日本OLYMPUS公司）于暗室观察，采集图像。根据镜下荧光强度判断分子表达，低倍镜及高倍镜下均未见荧光为阴性，低倍镜下及高倍镜下均可见荧光为阳性，低倍镜下可见弱荧光，高倍镜下明显可见荧光为阳性。手动计数表型分子与CD8α共染阳性细胞占CD8α阳性细胞百分比。

2.统计学方法：应用Graphpad Prism7软件，计量资料用±s表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、银屑病皮损浸润的CD8+细胞主要是CD8αα+T细胞

银屑病组皮损浸润的CD8+细胞表达T细胞标志CD3，不表达树突细胞标志CD11c和自然杀伤细胞标志CD56。银屑病组CD8+T细胞中CD8αα+表型占88.48%±7.39%，对照组皮肤局部仅有个别CD8+T细胞浸润，CD8αα+表型占14.43% ± 13.14%，两组比较差异有统计学意义（t=11.5，P＜0.01）。见图1。

二、银屑病皮损浸润的CD8αα+T细胞分泌IL⁃17A

银屑病皮损中分泌IL⁃17A的CD8αα+T细胞占24.85%±4.25%，健康对照组皮肤CD8αα+T细胞不分泌IL⁃17A，差异有统计学意义（t=5.853，P ＜0.01）。见图2。

图1 免疫荧光检测银屑病皮损与健康人皮肤局部浸润的CD8+细胞表型（×600） 银屑病皮损浸润的CD8+细胞表达T细胞标志CD3，不表达树突细胞标志CD11c与自然杀伤细胞标志CD56，主要为CD8αα+T细胞

图2 免疫荧光检测银屑病皮损及健康人皮肤局部CD8α与IL-17A共染情况（×600） 银屑病皮损浸润的CD8αα+T细胞分泌IL-17A的比例显著高于健康对照

三、银屑病皮损浸润的CD8αα+T细胞表型

银屑病皮损浸润的CD8αα+T细胞不表达CCR7和CD45RA，呈CD45RA-CCR7-效应记忆性T细胞表型，表皮浸润的CD8αα+T细胞98.3%±1.0%表达组织局部定植标志CD103，真皮浸润的CD8αα+T细胞基本不表达CD103；健康对照皮肤不表达CD103（图3A）。银屑病皮损浸润的CD8αα+T细胞上未见CD8+Treg细胞标志分子Foxp3、CD25和CD122（图3B）。

图3 免疫荧光检测银屑病皮损浸润的CD8αα+T细胞的表型（×600） 3A：银屑病皮损浸润的CD8αα+T细胞不表达CCR7与CD45RA，表达CD103，表达CD8αα+T细胞浸润于表皮；3B：银屑病皮损浸润的CD8αα+T细胞上未见CD8+Treg细胞标志分子Foxp3、CD25和CD122

讨 论

普遍认为，T细胞免疫紊乱是银屑病发病免疫学机制的中心环节［1］。以往研究发现，银屑病皮损局部有CD8+T细胞浸润［4］，Boniface等［7］发现，银屑病皮损浸润的CD8+T细胞部分是组织局部定植细胞，但其具体细胞表型尚不明确。CD8+细胞上表达的CD8分子有两种二聚体亚型，包括α链组成的同源二聚体CD8αα和α、β链组成的异源二聚体CD8αβ，两者功能有显著差别。CD8αβ作为T细胞共受体促进细胞活化，表达于杀伤性CD8+T细胞表面。CD8αα通过识别T细胞受体衍生的肽链靶向活化的T细胞发挥负向免疫调控功能［8］，可表达于CD8+T细胞，或非T细胞包括自然杀伤细胞和树突细胞表面［9］。以往研究发现，在肠道黏膜局部肠上皮淋巴细胞中，CD8αα+T细胞表型占43%［10］，在人皮损单纯疱疹复发皮损局部，CD8αα+T细胞主要分布于真表皮交界处［11］，而银屑病皮损浸润的CD8+T细胞是否有CD8αα+T表型尚不清楚。

我们发现，银屑病皮损真、表皮均有CD8+细胞浸润，通过检测银屑病皮损CD8α、CD8β及T细胞标志CD3、树突细胞标志CD11c和自然杀伤细胞标志CD56，确定了银屑病皮损浸润的CD8+细胞，主要是CD8αα+T细胞表型。为了进一步探究银屑病皮损浸润的CD8αα+T细胞的表型，我们检测了鉴别初始细胞分子CD45RA、记忆细胞分子CCR7与组织局部定植细胞标志CD103［12］。免疫荧光示，银屑病皮损浸润的CD8αα+T细胞呈CCR7-CD45RA-效应T细胞表型。表皮浸润的CD8αα+T细胞表达CD103，真皮浸润的CD8αα+T细胞不表达CD103，提示银屑病表皮浸润的CD8αα+T细胞是组织局部定植细胞，真皮处细胞可能来源于外周血。以往研究示，CD8αα+T细胞作为CD8+Treg细胞在小鼠肠道黏膜局部免疫中发挥负向免疫调控作用［10］。我们通过检测CD8+Treg亚群的标志Foxp3、CD25和CD122［13］，发现银屑病皮损浸润的CD8αα+T细胞非CD8+Treg表型，提示CD8αα+T细胞在银屑病患者皮损发挥的作用可能与小鼠肠道的CD8αα+T细胞不同。

银屑病发病机制中，IL⁃17A是关键的促炎因子［1⁃2］。近年来研究发现，IL⁃17A不仅来源于CD4+T细胞，CD8+T细胞、γδT细胞、中性粒细胞等也可以产生IL⁃17A，参与银屑病发生发展［1］。我们发现，银屑病皮损浸润的CD8αα+T细胞分泌IL⁃17A的细胞比例显著高于对照组，提示银屑病皮损浸润的CD8αα+T细胞通过分泌IL⁃17A参与银屑病的发生发展。

本研究发现，银屑病皮损处浸润的CD8+细胞主要为CD8αα+T细胞，通过分泌IL⁃17A参与银屑病的发病，拓展了对CD8αα+T细胞亚群及其功能的认识，明确了CD8+T细胞在银屑病发病中的作用，丰富了银屑病的免疫学机制，为CD8+T细胞在炎症性疾病中的作用研究提供了新思路。